HTLV-1 Tax 蛋白对T细胞中HMGB1调控的影响

目的探讨人T淋巴细胞白血病1型病毒（human T-cell leukemia virus 1,HTLV-1）Tax蛋白对人高迁移率族蛋白1（ high mobility group box 1,HMGB1）基因转录调控的影响。方法提取TaxN和TaxP细胞总RNA和蛋白质,通过real-time PCR和Western blot分析HMGB1 mRNA和蛋白质的表达情况;利用脂质体介导方法,将6个含有不同长度HMGB1调控序列的pGL3-HMGB1-luc瞬时转染至TaxN 和 TaxP 细胞,观察 HMGB1基因在不同 T 细胞中的转录活性;pCMV-Tax 与 pGL3-HMGB1-luc瞬时共转染至Jurkat细胞,观察Tax蛋白对HMGB1基因的转录调控影响;染色体免疫共沉淀（ ChIP）找寻Tax蛋白影响HMGB1基因转录调控的区段。结果 TaxP细胞中HMGB1 mRNA和蛋白质表达水平高于TaxN细胞。 TaxN和TaxP细胞中HMGB1调控趋势基本相似,均表现出3号质粒（pHLuc3,含有-504～＋83 HMGB1区段）的相对荧光素酶活性（HMGB1/neo）最高,但是6号质粒（含有-1163～＋83 HMGB1区段）却表现出 TaxP 细胞 HMGB1的转录活性明显高于 TaxN 细胞。pCMV-Tax与pGL3-HMGB1-Luc报告基因共转染到Jurkat细胞也显示,6号质粒（pHLuc6）中Tax促进HMGB1基因的转录。 ChIP分析证实了Tax蛋白可能富集在HMGB1的-1163～-1043区段。结论-504～-383可能是HMGB1基因转录激活的关键启动子区,Tax蛋白可能富集在HMGB1的-1163～-1043区段促进HMGB1基因转录。     

HMGB1调控区Jurkat稳定细胞株的构建

目的:构建不同长度的高迁移率族蛋白1(HMGB1)基因调控序列的真核表达载体及其稳定表达的Jurkat细胞株,为研究HMGB1基因在白血病发病机制建立基础。方法:以Jurkat细胞基因组为模板,PCR扩增3’端固定的8个不同长度的HMGB1调控基因(-83 bp～+83 bp、-383 bp～+83 bp、-504 bp～+83 bp、-688 bp～+83 bp、-975 bp～+83 bp、-1 163 bp～+83 bp、-1 327 bp～+83 bp、-1 520 bp～+83 bp),均将其连入pMD18-T载体,并转化大肠杆菌DH5a。对氨苄青霉素筛选的阳性克隆进行扩增、质粒抽提,应用KpnⅠ/HindⅢ、BamHⅠ/HindⅢ双酶切鉴定和DNA测序获得序列正确的阳性克隆,然后再经酶切连入pGL3-neo-luc质粒,成功构建HMGB1基因调控序列报告基因pGL3-HMGB1-luc(按由短至长顺序依次命名为1～8号质粒)。利用脂质体介导的方法将不同长度的pGL3-HMGB1-luc质粒和pGL3-neo-luc质粒分别转染至Jurkat细胞,48小时后加入终浓度600μg/ml的G418进行药物加压筛选,20天后得到有效转染pGL3-HMGB1-luc及pGL3-neo-luc载体的Jurkat细胞株(按有无HMGB1调控基因及其由短至长顺序,依次命名为NEO细胞和1～8号细胞)。通过检测荧光素酶活性,验证构建的Jurkat稳定细胞株(Jurkat-HMGB1)。结果:HMGB1调控基因成功插入到pGL3-neo-luc的XhoⅠ和HindⅢ位点之间构建出3号质粒;HMGB1调控序列1016 bp定向克隆至3号质粒的KpnⅠ和XhoⅠ位点之间,成功构建出8号质粒;将166、466、771、1 058、1 246、1 410 bp长度的HMGB1调控基因定向克隆至3号质粒的KpnⅠ和HindⅢ位点之间,分别构建出1号、2号、4号、5号、6号、7号质粒。8个质粒均经KpnⅠ/HindⅢ、BamHⅠ/HindⅢ双酶切,电泳显示条带与扩增的HMGB1调控序列长度一致。HMGB1-T载体的DNA测序结果与NCBI提供序列完全匹配。成功构建了不同长度的3’端固定的pGL3-HMGB1-luc报告基因。pGL3-neo-luc和pGL3-HMGB1-luc稳定转染至Jurkat细胞后,成功构建了NEO细胞和稳定细胞株HJ1～8,其荧光素酶发光值分别为:123、151 288、136 057、110 623、100 874、214 523、147 597、161 348、145 490。结论:构建的HMGB1调控序列报告基因和HJ稳定细胞株为找寻有意义的HMGB1调控区域,以及后期研究HMGB1基因在成人T淋巴细胞白血病中的发病机制奠定了基础。