筛选Fab抗体库的细菌展示技术的建立

目的:利用NlpA蛋白的前六个氨基酸(CDQSSS)将抗体锚定在细菌内膜建立筛选Fabs抗体库的展示技术,为今后抗体的研发工作奠定基础.方法:从pNAD质粒中克隆出NlpA leader(含有CDQSSS序列)基因序列,利用相应的酶切位点将该序列插入pComb3表达载体中构建成用于展示Fab的重组质粒pBFD.将从pEAI质粒克隆得到的anti-human IL-1β抗体的重链Fab和全长轻链分别插入到NlpA leader和pelB leader( pComb3载体自带的果胶酶基因前导肽)的下游.将pBFD-Fab转入到E.coli DH5α中诱导表达,原生质球制备后,采用梯度浓度的抗原进行孵育,最后经流式细胞术(FCM)检测抗体展示情况并且分选阳性群体,利用质粒提取的方法来替代PCR方法拯救阳性基因,转化E.coli DH5α,利用FCM再次检测该群体展示的抗体与抗原结合情况.结果:所展示的anti-hlL-1β Fab抗体依次与抗原和FITC标记的抗原特异性抗体孵育后,用FCM实时检测,结果显示出很强的荧光信号并且表现出抗原浓度依赖性.拯救出的pBFD-Fab-原生质球的FCM检测结果与首次展示的FCM结果一致,该系统能够稳定的展示抗体.结论:经过该细菌展示系统展示的Fab抗体能够有效的折叠,与相应的抗原具有很好的特异性结合能力.成功改进该展示技术的基因拯救方法,避免了基因突变和链置换的发生.此外还证明了该展示技术具有很好的稳定性.本实验成功构建了筛选Fab抗体库的细菌展技术.     

人IL-1β的克隆及其高效可溶性表达

目的:从人淋巴细胞中克隆白介素-1β(IL-1β)cD-NA,通过原核可溶性表达纯化,获得具有生物活性的可溶性IL-1β,为深入研究和利用IL-1β基因奠定基础.方法:从人PBMC中克隆出人成熟IL-1β基因,并插人到原核表达载体pSUMO中SUMO标签的下游,构建重组表达载体pSUMO-hIL-1β.将该载体转化大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达hIL-1β/SUMO融合蛋白,经Ni-NTA Agaroae纯化后,表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定.用protease-1切去SUMO标签,用Real time-PCR鉴定其对人T细胞表达的细胞因子的影响.结果:SDS-PAGE分析表明表达产物的相对分子质量(Mr)为37 000,成熟蛋白Mr为17 000,与理论值相符.灰度扫描分析融合蛋白的表达量占菌体蛋白总量的约30%左右,主要以可溶形式存在.Western blot证实该蛋白为hIL-1β.成熟蛋白纯化产物纯度超过90%以上.通过RT-PCR检测证明其具有刺激人T细胞大量表达多种细胞因子(IL-1β,IL-4,IL-10,IL-18,IFN-γ,TGF-β,TNF-α)的活性.结论:利用大肠杆菌表达系统完全可以高效可溶性表达较高纯度的具有生物活性的hIL-1β蛋白.     

酵母展示筛选scFv方法的建立

目的:利用酵母展示技术建立筛选scFvs的技术平台,为今后从抗体库中筛选高亲和力抗体奠定基础.方法:改造pYD1载体,将其自身所带的GS Linker 上下游两端突变出酶切位点,构建成pYD-x;分别将IL-1β抗体的重链与轻链可变区片段插入pYD-x中GS Linker的上下游,构建出重组质粒pYSD1.从pYSD1上PCR扩增出scFv片段,并将其插入pYD1的MCS区,构建出重组质粒pYSD2.将pYSD1与pYSD2分别转入酿酒酵母EBY100中诱导表达scFv,并用流式细胞术(FCM)检测抗体展示情况.结果:经诱导后,从流式细胞仪检测结果中可以看出EBY100-pYSD1所展示的scFv与抗原结合力很弱,而EBY100-pYSD2则表现出一定强度的结合.结论:本实验证明了pYD-x载体上存在的额外的GS Linker对于抗体展示的必要性,并且成功建立了利用酵母展示载体pYD1进行scFvs筛选的技术平台.