基于细胞骨架差异的心肌细胞纯度快速鉴定方法

目的 寻找并确定一种优于传统且简单快速的心肌细胞鉴定方法。方法 取1～3d龄SD大鼠心脏,0.1%Ⅱ型胶原酶消化,差速贴壁分离心肌细胞与心肌成纤维细胞,对心肌细胞使用5-溴脱氧尿嘧啶进行纯化,并通过传代对心肌成纤维细胞进行纯化。采用免疫荧光法,Phalloidin固定染色和Tubulin Tracker活细胞染色鉴定心肌细胞与心肌成纤维细胞。结果 心肌细胞的微丝与微管可分别被Phalloidin和Tubulin Tracker标记,而心肌成纤维细胞的微丝和微管均未被标记,且这两种染色方法耗时极少。结论 基于细胞骨架差异的特征,通过标记微丝或者微管能够简便快速鉴别心肌细胞和心肌成纤维细胞。本方法明显优于免疫荧光染色,将提高心血管疾病在细胞水平上的研究效率。     

海人酸活化的小胶质细胞H_2O_2、NO的分泌对海马神经元谷氨酸含量的影响

目的:初步探讨海人酸(KA)活化培养的新生SD大鼠小胶质细胞(MG)及其分泌的一氧化氮/过氧化氢(NO/H2O2)、海马神经元、谷氨酸(Glu)之间的相互关系。方法:以KA作为MG的激活剂,以一氧化氮合成酶(NOS)的抑制剂氨基胍(AG)或过氧化氢的水解酶(CAT)作为工具药,先检测原代分离纯化培养的MG在KA激活后及工具药作用后各组条件培养液中NO和H2O2含量的变化,再用各组小胶质细胞条件培养液孵育离体海马神经元,观察其对神经元内Glu表达的影响。结果:KA作用后各组条件培养液中NO和H2O2含量明显升高,经AG或CAT处理后各组条件培养液中NO和H2O2含量显著降低;海马神经元的Glu免疫反应性KA组较对照组明显增强,在AG+KA组和CAT+KA组较KA组明显减弱。结论:活化的MG可能通过氧化损伤机制作为参与癫痫发作一个重要环节,提示采取抑制小胶质细胞活化、减少氧化损伤也可能是癫痫防治研究的一个重要方向。     

高糖高脂促进人脐静脉内皮细胞间充质转化

目的 探究高糖高脂刺激对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)间充质转化的影响。方法 将培养至第6代的HUVEC设为对照组(CON组),以常用的间充质转化诱导剂TGF-β1为阳性对照(TGF-β1组),给予33mmol/L高糖加0.1mmol/L棕榈酸模拟高糖高脂环境对HUVEC进行刺激为HG+HP组,显微镜下观察细胞形态变化。并通过免疫荧光、Western-blot法检测内皮细胞特异性的标记因子VE-Cadherin和CD31,以及平滑肌细胞特异性标记因子α-SMA和N-Cadherin等蛋白的表达情况。结果 显微镜下观察发现,HUVEC经过TGFβ1培养处理72h后,细胞形态由饱满圆润的短梭形逐渐变成了长梭形,细胞间隙变大,与CON组相比有明显改变,而HG+HP组细胞形态与TGF-β1组相似。免疫荧光和Western-blot结果显示,与CON组相比,HG+HP组内皮细胞标记物VE-Cadherin和CD31表达量显著下降(P<0.05),而平滑肌细胞标记物α-SMA和N-Cadherin表达量显著上升(P<0.05)。结论 高糖高脂刺激可以促进人脐静脉内皮细胞的间充质转化。     

右旋葡萄糖对新生大鼠海马神经元AMPA受体亚基GluR2/3表达的影响

目的:观察右旋葡萄糖对新生大鼠海马神经元细胞谷氨酸离子型受体GluR2/3 mRNA表达的影响。方法:建立原代新生大鼠海马神经元细胞培养方法,培养至第9 d时,给予不同浓度右旋葡萄糖刺激。通过免疫荧光检测海马神经元细胞GluR2表达,通过RT-PCR检测GluR2、GluR3、GluR4 mRNA表达变化。结果:新生大鼠海马神经元细胞培养至第9 d时,可见GluR2呈阳性表达,右旋葡萄糖刺激后海马神经元细胞GluR2mRNA、GluR4mRNA表达明显下调(P0.05);GluR3 mRNA表达明显上调(P0.01)。结论:右旋葡萄糖刺激引起海马神经元细胞GluR受体下调,表现对海马神经元的损伤性影响,可能与糖尿病脑病的发生机理有关。     

人G6PD在大肠埃希菌中的表达及体外抑制剂筛选模型的建立

目的 表达人6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD)并建立其体外抑制剂筛选模型。方法 设计一对5′端分别带NdeⅠ、XhoⅠ位点的引物,PCR扩增G6PD cDNA。将cDNA和质粒pET-28a经NdeⅠ+XhoⅠ酶切后连接,连接产物转化大肠杆菌Top10。将鉴定的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用0.4 mmol/L IPTG诱导G6PD表达,镍离子亲和层析柱纯化G6PD。以6-磷酸葡萄糖(G6P)和烟酰胺腺嘌呤核苷二磷酸(NADP+)为G6PD的底物和辅因子,检测340 nm波长处光吸收值(A₃₄₀)的变化,确定G6PD及其抑制剂脱氢表雄酮(DHEA)的最佳浓度,计算模型的可靠性指数—Z′因子。结果 构建了重组质粒pET-28a-G6PD,重组菌BL21(DE3)-pET-28a-G6PD经IPTG诱导后,可溶性G6PD表达量为2.5 mg/L,G6PD、DHEA的最适浓度分别为900μg/L、20μmol/L,筛选模型的Z′因子为0.88。结论 在大肠杆菌中表达了有活性的G6PD,建立了可靠的体外抑制剂筛选模型。     

降低海马NO含量对凋亡相关因子的调节作用

目的探讨降低海马NO含量对凋亡相关因子的调节作用。方法体内和体外实验均分为4组:生理盐水对照组(NS组),海人酸致痫组(KA组),氨基胍预处理+海人酸组(AG+KA组)和氨基胍组(AG组)。采用免疫细胞化学法显示体外培养的海马神经元在不同处理因素作用24h和48h后bcl-2、bax的免疫反应性。采用Western blot法或半定量RT-PCR法检测各组大鼠造模后24h、48h时bcl-2、bax蛋白及Apaf-1mRNA的表达情况。结果在体外实验中,KA组bcl-2的免疫反应较NS组减弱而bax的免疫反应增强;AG+KA组bcl-2的免疫反应较KA组增强而bax的免疫反应减弱;AG组与NS组相比无明显差异。体内实验中,Western blot检测显示大鼠海马组织中bcl-2和bax蛋白的表达水平呈负相关,其趋势与体外实验结果一致;半定量RT-PCR检测显示Apaf-1mRNA的含量在造模后24h和48h时间点,KA组明显高于NS组(P<0.05),而AG预处理则明显拮抗KA诱导的Apaf-1mRNA高表达。结论降低NO含量可以上调bcl-2蛋白的表达,下调bax和Apaf-1mRNA的表达。     

姜黄素对糖尿病大鼠大脑的影响

目的 观察姜黄素(curcumin,Cur)对链脲佐菌素(STZ)诱导的2型糖尿病大鼠大脑行为学及形态学的影响。方法 雄性SD大鼠随机分为3组:生理盐水对照组(Con组),糖尿病模型组(DM组)和姜黄素处理的糖尿病组(DM+Cur组)。以Morris水迷宫实验方法检测各组大鼠的行为学差异,HE染色法检测各组大鼠大脑皮层及海马的形态学差异。结果 Morris水迷宫检测发现,DM组大鼠航行轨迹复杂,逃避潜伏期比对照组明显延长,撤出平台以后,大鼠穿越平台位置的次数明显减少,而给予姜黄素处理16周后的DM+Cur组可明显改善大鼠的行为学表现,增强大鼠的学习记忆能力。HE染色发现,DM组大鼠海马CA1、CA3和齿状回(DG)区有部分神经元出现变性改变,而DM+Cur组大鼠可明显改善大鼠海马神经元的变性发生。结论 姜黄素能改善糖尿病大鼠的学习记忆能力,对糖尿病大鼠的海马神经元起保护作用。     

H2O2在戊四氮致痫模型中对海马神经元兴奋毒性的影响

目的 研究戊四氮致痫模型中,大鼠海马过量产生的H 2O 2对海马神经元兴奋毒性的影响.方法 SD雄性大鼠随机分为3组,每组14只.A组为生理盐水对照组,B组为戊四氮致痫组,C组为H 2O 2酶处理+戊四氮致痫组.动物造模后,观察各组大鼠癫痫发作情况;然后分别采用分光光度法测定大鼠海马H 2O 2含量,免疫组织化学法(SABC法)检测大鼠海马谷氨酸(Glu)免疫反应性,RT-PCR法检测大鼠海马Caspase-3 mRNA水平.结果 A组大鼠无明显癫痫发作,B组大鼠有癫痫大发作达Ⅴ级,C组大鼠癫痫发作为Ⅱ～Ⅲ级.B组大鼠海马H 2O 2含量、Glu免疫反应性、Caspase-3 mRNA表达水平均显著高于A组(均 P ＜0.05),C组海马H 2O 2、Glu免疫反应性、Caspase-3 mRNA表达水平均明显低于B组(均 P ＜0.05).结论 戊四氮诱发癫痫发作后,导致H 2O 2过量产生,其对海马神经元具有兴奋毒性作用.     

姜黄素对糖尿病大鼠心肌自噬,凋亡及AMPK-mTOR信号通路的影响

目的:基于心脏组织AMPK/mTOR信号通路、自噬和凋亡来探讨姜黄素(curcumin,Cur)对糖尿病大鼠心脏损伤的保护作用。方法:50只雄性SD大鼠被随机分为3组:正常对照组(Con,n=10)给予正常饮食以及等量生理盐水腹腔注射;糖尿病模型组(DM,n=40)大鼠给予高糖高脂饮食联合连续5 d腹腔注射链脲佐菌素(streptozocin,STZ) (35 mg·kg^-1·d^-1),给药组(Cur+DM),部分糖尿病大鼠(n=20)在其饮用水中给予Cur(300 mg·kg^-1·d^-1)进行干预16周。HE染色观察大鼠心脏组织形态改变;透射电镜观察大鼠心脏组织粒体形态变化;TUNEL染色,免疫组织化学和蛋白印迹等方法检测心脏组织自噬、凋亡,AMPK/mTOR信号通路等相关蛋白的表达情况。结果:与正常对照组相比,糖尿病模型组大鼠心肌肥大,线粒体嵴稀疏、断裂,自噬及相关蛋白表达水平下降(P<0.05),细胞凋亡及相关蛋白表达水平显著增加(P<0.05),P-AMPK/AMPK蛋白表达水平降低(P<0.05)而P-mTOR/mTOR增加(P<0.05)。与糖尿病模型组比较,给药组大鼠心肌肥大水平和线粒体断裂程度减轻,自噬及相关蛋白表达水平增加(P<0.05),细胞凋亡及相关蛋白表达水平减轻(P<0.05),P-AMPK/AMPK蛋白表达水平增加(P<0.05),而P-mTOR/mTOR减少(P<0.05)。结论:姜黄素可能通过活化AMPK/mTOR信号通路增强糖尿病大鼠心脏组织自噬水平,减轻心脏组织细胞凋亡,从而改善糖尿病大鼠心脏损伤。