细胞培养技术教学模式的探索与思考

细胞生物学是一门实验性很强的学科,是理论知识和实践操作密切相关的学科。大部分医学研究生在研究生阶段要掌握细胞生物学理论知识,并进行一系列细胞生物学课题研究。因此掌握最基本的细胞培养技术就显得尤为重要。作为细胞培养室的技术指导老师,在几年教学中,我不断优化和总结教学内容和教学模式,目的是培养学生实事求是的科学态度,使学生尽快养成良好的实验习惯、掌握细胞培养的基本技能。     

大鼠牙髓干细胞与骨髓间充质干细胞分化成骨样细胞能力对比研究

目的：以骨髓间充质干细胞作为参考,讨论牙髓干细胞作为骨组织修复种子细胞的可行性。方法：通过酶消化法获得大鼠牙髓干细胞,离心法获得骨髓间充质干细胞,贴壁培养,通过倒置光学显微镜观察二者形态差异;流式细胞技术鉴定骨髓间充质干细胞的间质细胞表面标志物表达;MMT法检测细胞生长曲线;特定的成骨诱导液诱导干细胞成骨分化,免疫荧光法检测成骨细胞表面标志物表达。结果：分离的大鼠骨髓间充质干细胞与牙髓干细胞形态学以及生长特性具有相似性,且符合间充质干细胞特性,牙髓干细胞第4天进入对数生长期,第7天进入平台期,骨髓间充质干细胞第4天进入对数生长期,第8天进入平台期;经过成骨诱导后二者都具备成骨样细胞分化能力,牙髓干细胞在成骨诱导后的骨钙素表达上与骨髓间充质细胞有着相似的能力;牙本质泌涎蛋白表达阳性。结论：牙髓干细胞具有与骨髓间充质干细胞都具有成骨分化能力,但牙髓干细胞细胞成分相对复杂,增殖能力较强。     

两种成脂诱导培养基诱导人和大鼠脂肪干细胞的研究

目的：比较两种培养基诱导人和大鼠脂肪干细胞(Adipose-derived stem cell, ADSC)的成脂分化能力,探寻更为适宜的ADSC成脂诱导方案。方法：提取3例临床患者的脂肪干细胞(hADSCs)及出生6周大鼠的脂肪干细胞(rADSCs)。将hADSCs、rADSCs分别接种于六孔板,分为未诱导组、成脂诱导Ⅰ组和Ⅱ组,分别使用普通培养基,成脂诱导培养基Ⅰ和Ⅱ,培养10天后以油红O染色,镜下观察及检测490nm吸光度值(OD490),比较脂滴形成情况。结果：未诱导的hADSCs和rADSCs均呈成纤维细胞样生长。成脂诱导培养3天后出现脂滴;油红O染色显示,成脂诱导组脂滴呈橘红色。hADSCs和rADSCs的成脂诱导Ⅱ组形成的脂滴均明显大于诱导Ⅰ组,统计学分析显示hADSCs的成脂诱导Ⅱ组测得的OD490明显高于诱导Ⅰ组（P<0.01); 而两组的rADSCs的OD490无明显差异（P>0.05）。结论：hADSCs和rADSCs在两种诱导培养基中均可成脂分化,但成脂诱导Ⅱ组优于成脂诱导Ⅰ组。     

OCT4异构体在人胚胎干细胞和间充质干细胞中的表达

目的比较OCT4异构体(OCT4A、OCT4B、OCT4B1)及其调控因子在人胚胎干细胞(hESC)和人间充质干细胞(hMSC)中的表达。方法利用RT-PCR、免疫荧光染色、流式细胞分析及体内/外分化实验,鉴定hESC及hMSC的生物学特性;应用real-time PCR、Western blot和流式细胞分析比较OCT4异构体及其转录因子NANOG,SOX2和mRNA结合蛋白LIN28在hESC及hMSC中的表达水平。结果 OCT4异构体mRNA在hESC和hMSC中均有表达,在hESC中的表达显著高于在hMSC中,并以OCT4A的差别最为显著(P0.01);在蛋白水平,hESC表达OCT4A和OCT4B-256aa,hMSC不表达OCT4异构体蛋白。hESC高表达OCT4的调控因子NANOG、SOX2和LIN28;hMSC低表达SOX2,不表达NANOG和LIN28。结论 NANOG、SOX2和LIN28调控OCT4的表达,OCT4异构体在hESC和hMSC中的表达差异提示其可能是不同发育阶段干细胞自我更新和分化潜能等方面差别的主要因素之一。     

两种培养基诱导人和大鼠脂肪干细胞向脂肪细胞分化的比较

目的比较两种培养基诱导人和大鼠脂肪干细胞(adipose-derived stem cell,ADSC)的成脂分化能力,探寻更为适宜的ADSC成脂诱导方案。方法提取3例临床患者的脂肪干细胞(h ADSCs)及出生6周大鼠的脂肪干细胞(r ADSCs),将h ADSCs、r ADSCs分别接种于六孔板,分为未诱导组、成脂诱导I组和II组,分别使用普通培养基、成脂诱导培养基I和II,培养10 d后以油红O染色,镜下观察及检测490 nm吸光度值(A490),比较脂滴形成情况。结果未诱导的h ADSCs和r ADSCs均呈成纤维细胞样生长,成脂诱导培养3 d后出现脂滴;油红O染色显示,成脂诱导组脂滴呈橘红色,h ADSCs和r ADSCs的成脂诱导II组形成的脂滴均明显大于诱导I组,统计学分析显示h ADSCs的成脂诱导II组测得的A490明显高于诱导I组(P<0.01);而两组的r ADSCs的A490无明显差异(P>0.05)。结论 h ADSCs和r ADSCs在两种诱导培养基中均可成脂分化,但成脂诱导II组优于成脂诱导I组。