甜叶悬钩子苷通过NF-κB和MAPK信号通路抑制小鼠神经炎症细胞模型炎症反应

目的：通过体外实验探究甜叶悬钩子苷(RUB)对脂多糖(LPS)诱导小鼠BV-2小胶质细胞神经炎症反应的影响及改善机制。方法：采用CCK-8法检测RUB对BV-2细胞活力的影响;使用LPS诱导BV-2小胶质细胞建立神经炎症细胞模型,用不同浓度RUB进行干预,将BV-2细胞分为对照组、LPS模型组及LPS+RUB(25、50和100μmol/L)干预组,采用ELISA法检测细胞上清中白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的浓度;RTqPCR法检测促炎细胞因子环加氧酶2(COX-2)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、IL-1β和TNF-α的mRNA表达水平;Western blot法检测NF-κB和MAPK信号通路相关蛋白的表达;免疫荧光染色观察细胞中p65的表达情况。结果：与对照组相比,LPS诱导后细胞上清液中IL-1β和TNF-α的分泌量增加(P<0.01),促炎细胞因子COX-2、iNOS、IL-1β和TNF-α的mRNA水平显著增加(P<0.01),NF-κB和MAPK信号通路蛋白表达显著上调(P<0.05或P<0.01),且p65出现荧光...     

RAW264.7细胞MyD88基因缺失株构建北大核心CSCD

目的:构建MyD88基因缺失的RAW264.7细胞株,为探寻MyD88基因的作用提供重要载体。方法:制备HBLV-Cas9-PURO慢病毒,感染RAW264.7细胞,得到RAW264.7-Cas9细胞株。依据CRISPR/Cas9系统原理,设计3条靶向MyD88基因的sgRNA,慢病毒包装后感染RAW264.7-Cas9细胞株,观察感染效果,PCR和Western blot验证MyD88基因敲除水平并筛选稳转细胞株。选取敲除效果最佳株,经LPS和PGN诱导后,荧光定量PCR和ELISA检测TNF-α表达和分泌。结果:HBLV-Cas9-PURO感染后RAW264.7细胞Cas9基因扩增明显升高,RAW264.7-Cas9细胞株构建成功。包装目的基因的慢病毒感染RAW264.7-Cas9后,荧光显微镜观察导入成功;PCR显示与对照组相比,HBLV-m-MyD88 gRNA3-GFP感染后MyD88基因表达显著下调;Western blot进一步证实,HBLV-m-MyD88 gRNA1-GFP和HBLV-m-MyD88 gRNA3-GFP感染后MyD88蛋白表达下降,且HBLV-m-MyD88 gRNA3-GFP组下降最为显著。LPS和PGN诱导HBLV-m-MyD88 gRNA3-GFP组细胞后,TNF-α表达和分泌水平均下调。结论:利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9技术成功构建稳定敲除MyD88基因的RAW264.7细胞株。