慢病毒载体介导的 RNA干扰对 HDAC2基因表达的影响

目的：构建组蛋白去乙酰化酶2（ HDAC2）基因的慢病毒表达载体,研究HDAC2基因在肝癌HepG2细胞中的表达。方法：将前期构建并鉴定正确的3条重组表达质粒pLKO.1-HDAC2-shRNA 1组、2组、3组及1条阴性对照pLKO.1-HDAC2-shRNAneg和空载体对照pLKO.1,运用脂质体法分别与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2. G共同转染人胚肾细胞293T,制备具有感染能力慢病毒颗粒;收集、纯化含病毒颗粒的上清液并感染人肝癌HepG2细胞,设未处理HepG2细胞为空白对照,采用Real time PCR 和Western blotting检测感染48 h和72 h后HepG2细胞中HDAC2基因mRNA和蛋白表达水平,鉴定、分析重组质粒的干扰效果。结果：与空白对照组相比,3条干扰序列转染肝癌HepG2细胞后均能明显抑制HDAC2 mRNA的表达（ P＜0.05）,其中以pLKO.1-HDAC2-shRNA 1组的抑制率更明显,达到82.09％;3条干扰序列均能明显抑制HDAC2蛋白的表达（ P＜0.05）,以pLKO.1-HDAC2-shRNA 1组和3组的干扰效果最明显,但两者相比较差异无统计学意义（ P＞0.05）。结论：构建的重组质粒pLKO.1-HDAC2-shRNA能从转录水平和蛋白水平有效抑制HDAC2基因在HepG2细胞中表达。     

HDAC2基因RNA干扰载体的构建

目的:构建组蛋白去乙酰化酶2 (HDAC2)基因RNA慢病毒干扰质粒载体.方法:对比HDAC2基因序列,设计并合成短发夹RNA(shRNA)干扰靶点序列,克隆入经AgeI与EcoRI双酶切后的RNA干扰载体pLKO.1-puro,构建pLKO.1-HDAC2-shRNA重组质粒,采用酶切法和测序法验证重组质粒.结果:成功退火合成3对短发夹RNA序列并将其克隆入pLKO.1-puro载体中,构建重组质粒pLKO.1-HDAC2-shRNA1、pLKO.1-HDAC2-shRNA2及pLKO.1-HDAC2-shRNA3,经酶切鉴定和测序验证重组质粒载体与预期靶序列相同.结论:成功构建HDAC2-shRNA慢病毒干扰载体,为进一步研究HDAC2的功能及应用提供有效工具.     

DENV-2感染的HUVECs与调节性T细胞相互作用对主要炎性细胞因子产生的影响北大核心CSCD

目的研究人原代脐静脉内皮细胞（primary human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）被登革病毒2型（DENV-2）感染后,与调节性T细胞（regulatory T cells,Treg）共培养,HUVEC与Treg细胞相互作用对各自主要炎性细胞因子的影响。方法用密度梯度离心法从人浓缩白细胞分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）,磁珠阴性分选Treg细胞,流式细胞术检测CD4＋CD25＋CD127＋细胞纯度。HUVECs经DENV-2感染后,用Transwell与Treg细胞共培养,对照组用鞘氨醇-1-磷酸（sphingosine-1-phosphate, S1P）1型特异性受体激动剂CYM-5442预处理24 h去除药物后感染病毒,并与Treg细胞共培养,real-time RT-PCR分别检测HUVECs的IL-6、IL-8、TNF-α和Treg细胞的IL-10、TGF-β的mRNA转录水平;双抗体夹心ELISA法检测培养上清中上述细胞因子表达。结果感染后HUVECs中DENV-2 NS1基因转录水平逐渐上升,在24 h达到峰值（3.03±0.26,P〈0.01）后下降。流式细胞术检测经免疫磁珠阴性分选的Treg细胞纯度为（84.3±0.5）%。DENV-2感染后HUVECs的IL-6、IL-8、TNF-α mRNA转录均有上调,感染后24 h IL-6、IL-8、TNF-α的mRNA转录量分别为16.64±2.64、26.80±5.81和5.25±0.42,而未感染组的转录水平分别为1.70±0.68、1.68±0.74、1.45±0.15,与Treg共培养后上述细胞因子在各时间点的转录有所降低,但仍高于未感染DENV-2的对照组。CYM-5442预处理后被感染的HUVECs IL-6、IL-8、TNF-α的mRNA转录水平显著下降;共培养的Treg细胞所产生的IL-10、TGF-β也下调。结论被DENV-2感染的原代HUVECs能增强Treg细胞IL-10与TGF-β的分泌,同时Treg细胞产生的抑制性细胞因子能降低被感染的HUVECs炎性细胞因子的产生。     

DENV-2 诱导HUVECs 自噬和影响细胞活力的研究

目的:通过利用登革域型病毒(DENV-2)感染原代人脐静脉内皮细胞(HUVECs)后,研究病毒诱导HUVECs 产生自噬和对细胞活力的影响。方法:利用DENV-2 NGC 株感染HUVECs,Real-time PCR 检测HUVECs 中DENV-2 NS1 基因部分系列的表达,给予自噬诱导剂雷帕霉素(RAPA)和自噬抑制剂氯喹(CQ)预处理观察细胞自噬通量变化,激光共聚焦显微镜观察自噬体形成;CCK-8 检测细胞活力;Western blot 检测自噬通量标志性蛋白LC3、P62 的蛋白表达量。结果:DENV-2 感染HUVECs 组病毒NS1 基因在各时间点均有表达;被感染的HUVECs 在24 h 时细胞活力下降不明显,36、48 h 细胞活力分别下降至未处理组82.46%和78.47%,差异具有显著统计学意义(P<0.05);HUVECs 被DENV-2 感染后,LC3-Ⅱ蛋白量表达明显增高,自噬底物P62 表达明显降低,36、48 h 时间点相较未处理组具有统计学意义(P<0.05),与RAPA 处理组结果相似(P>0.05)。CQ 处理组LC3-Ⅱ及P62 蛋白量表达均明显升高,36、48 h 时间点相较未处理组具有显著性差异(P<0.05)。HUVECs被DENV-2 感染36 h,激光共聚焦显微镜观察到LC3-Ⅱ表达明显高于未处理组,自噬诱导剂RAPA 处理HUVECs 后,LC3-Ⅱ表达明显增加,自噬强度更加明显。DENV-2 与CQ 联合处理组相较DENV 单独处理组,36 h 细胞活力下降了13.61%,差异具有显著统计学意义(P<0.05)。结论:DENV-2 感染可抑制HUVECs 的生长;而DENV-2 诱导HUVECs 产生的自噬却有利于HUVECs 的存活。     

登革病毒域型引起原代HDMECs 通透性变化机制的初步研究

目的:了解登革病毒域型(Dengue virus Type 2,DENV-2)感染原代人真皮微血管内皮细胞(Primary Human dermal micro-vascular endothelial cells,pHDMECs)引起细胞通透性改变的机制。方法:用103 TCID50 的DENV-2 感染pHDMECs;于4、8、12、24、48 h Real time-PCR、免疫荧光法及流式细胞术检测DENV-2 NS1 部分序列及蛋白;Transwell 法检测细胞通透性;Real time -PCR 和双抗体夹心ELISA 法检测IL-6 和IL-8 的变化;流式细胞术检测24、48、72 h 细胞凋亡。结果:DENV-2 感染的pHDMECs 病毒NS1 基因相对表达上调,但未检测到病毒NS1 蛋白;DENV-2 感染的pHDMECs 通透性在24、48 h 显著升高;pHDMECs 被感染72 h 后凋亡也无明显变化; IL-6 和IL-8 mRNA 分别在8、24 h 相对表达上调[IL-6:(2.490.5)倍,P<0.05;IL-8:(6.82±1.69)倍,P<0.05];对照组和感染组分泌的IL-6 于8 h 分别为(869.6±50.7)、(1 248.8±86.9)pg/ ml,P<0.05;IL-8 于48 h 分别为(967.6±156.6)、(1 331.0±86.3)pg/ ml,P<0.05。结论:DENV-2 能感pHDMECs;pHDMECs 被DENV-2 感染后,细胞的通透性增加与凋亡无关,与促炎性细胞因子IL-6 和IL-8 明显上调关系密切。