螺内酯诱导人急性白血病细胞Jurkat凋亡的作用研究

目的研究螺内酯对人急性白血病细胞Jurkat体外增殖的抑制及诱导凋亡的作用。方法将终浓度分别是10、50及100μmol/L的螺内酯加入Jurkat细胞的培养体系中,24 h内每隔4 h通过MTT法分析Jurkat细胞的增殖抑制率,Annexin V/PI流式细胞术法分析Jurkat细胞的早期凋亡率。结果螺内酯与Jurkat细胞共同培养12 h后,螺内酯能显著增加对细胞的增殖抑制作用,并且与药物浓度成正相关,各浓度组的抑制率随着培养时间的延长而升高,与药物干预时间成正相关;螺内酯处理Jurkat细胞24 h,各浓度组诱导细胞凋亡率分别为:10μmol/L组(11.2±0.35)%、50μmol/L组(29.8±1.27)%及100μmol/L(56.5±1.41)%,各个浓度组诱导细胞凋亡率与药物浓度成正相关。结论螺内酯对人T淋巴细胞白血病Jurkat细胞具有抑制增殖和诱导凋亡的作用,提示该药可能具有潜在抑瘤作用。     

抗人CD86单链抗体的基因克隆、表达及结合活性分析

目的 构建并在CHO细胞中表达抗人CD86单链抗体(CD86-scFv),研究该抗体与抗原的结合特性及介导的生物学功能.方法 从分泌鼠源CD86抗体的杂交瘤细胞中克隆出VH和VL基因,构建含有前导肽L-VH-Linker-VL抗体编码基因的表达载体并转染CHO细胞.经筛选高分泌株并扩大培养后收集上清进行纯化.流式细胞术分析CD86-scFv对不同细胞膜型CD86分子的识别及与鼠源亲本抗体1D1的竞争抑制效应.MTT法分析CD86-scFv与Raji细胞表达的CD86结合后对细胞生长的影响.结果 获得了稳定表达抗人CD86-scFv的CHO细胞株及相应抗体.CD86-scFv与CD86基因转染细胞株L929-CD86、天然表达CD86分子的人B系淋巴瘤细胞Raji和Daudi细胞的阳性结合率分别为67.0％、72.3％和80.5％.CD86-scFv对鼠源亲本抗体1D1具有竞争结合能力,将CD86-scFv(终浓度20μg/mL)加入Raji细胞共同培养72 h时的细胞生长抑制率为28.3％.结论 成功构建了稳定分泌抗人CD86-scFv的CHO细胞株(命名为SA-IV).该抗体能够识别CD86分子并具有良好的生物学活性.     

抗人CD80单链抗体对不同肿瘤细胞膜型CD80分子的识别与体外增殖的影响

目的:制备真核细胞CHO表达的CD80单链抗体(CD80-scFv)并研究其对不同肿瘤细胞膜型分子的识别及增殖的影响。方法:将表达CD80-scFv的CHO细胞大规模无血清培养收集上清,采用IMAC亲和层析法纯化获取抗人抗体。采用免疫荧光及流式细胞术分析其对人恶性B系淋巴瘤细胞株Daudi、人黑色素瘤细胞株A375、神经胶质瘤细胞株U251及人多发性骨髓瘤细胞株8266及U266细胞膜型CD80分子的识别。在上述肿瘤细胞的培养体系中加入不同浓度的CD80-scFv,MTT法分析其对肿瘤细胞增殖的影响。以天然高表达CD80分子的8266细胞经丝裂霉素处理后作为APC,人PBMC作为效应细胞,分析抗体通过阻断共刺激信号对PBMC增殖的影响。结果:从CHO细胞培养上清中获取的抗人CD80-scFv纯化品的量为6.67 mg/L;该抗体与Daudi、U251、A375、8266及U266的阳性结合率分别为96.8%、39.6%、20.5%、99.9%及3.8%。抗体对高表达CD80分子的Daudi及8266细胞具有增殖抑制作用,加入抗体(终浓度为25μg/mL)培养72 h时的抑制率分别为24.04%及24.16%。同时,抗体通过阻断CD80-CD28介导的共刺激信号,抑制PBMC的增殖。结论:CD80-scFv能够特异识别细胞膜型CD80分子,并对高表达细胞的体外增殖具有抑制作用。     

抗人CD86双价抗体的表达及与抗原的结合特性

目的:用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞表达抗人CD86双价抗体(CD86-diabody),鉴定该抗体对表达CD86分子肿瘤细胞的识别及介导的生物学效应.方法:从分泌抗人CD86小鼠源抗体的杂交瘤1D1中克隆抗体重、轻链可变区基因VH及VL.SOE-PCR构建VH-(GGGGS)-VL双价抗体基因,整合到真核表达载体plRES2-EGFP中,脂质体法转染CHO细胞,FCM筛选G418加压培养的阳性克隆.IMAC纯化并定量抗体.免疫荧光法分析抗体对人B系淋巴瘤细胞株Raji及Daudi膜型CD86分子的阳性结合率,将抗体加入到Raji细胞的培养体系中,培养72 h,MTT法分析抗体对细胞体外增殖的影响.结果:获得了稳定分泌抗人CD86-diabody的CHO细胞株.培养上清中抗体纯品的得率为5.24 mg/L.抗体与Raji及Daudi细胞的阳性结合率分别为77.2％及70.6％.经抗体孵育72 h,Raji细胞体外增殖抑制率为37％.结论:成功制备了抗人CD86-diabody,可特异性结合细胞膜型CD86分子,并对表达该分子的肿瘤细胞体外增殖具有抑制效应.     

D-半乳糖致衰老小鼠脾脏T细胞亚群的改变及其意义

目的:探讨D-半乳糖所致亚急性衰老小鼠脾脏T细胞亚群的改变及其意义。方法:运用100 g/L D-半乳糖溶液建立小鼠亚急性衰老模型,并对此衰老模型进行生物学鉴定。ELISA检测模型小鼠血清中IFN-γ和IL-4的含量;流式细胞术检测模型小鼠脾脏中初始、活化及调节性T细胞相关分子的改变。结果:模型组小鼠血清中IFN-γ和IL-4含量分别为(82.93±2.74)pg/mL和(125.41±3.16)pg/mL,与对照组[(125.41±3.16)pg/mL和(8.28±2.47)pg/mL]相比含量降低(P<0.01)。脾脏中初始T细胞相关分子CD45RA表达下降[模型组:(4.46±1.21)%,对照组:(7.38±1.03)%,P<0.01];活化T细胞相关分子CD25表达下降[模型组:(6.74±0.81)%,对照组:(5.14±1.25)%,P<0.05];Foxp3在CD4+CD25+T细胞中表达上升[模型组:(18.32±1.44)%,对照组:(10.14±1.52)%,P<0.05]。结论:机体衰老时脾脏中初始和活化T细胞减少,CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Tr)增多,T细胞活化及免疫调节能力下降。     

D-半乳糖所致衰老小鼠抗原提呈细胞的改变及其意义

目的:研究D-半乳糖所致衰老小鼠专职性抗原提呈细胞的改变及其意义。方法:取健康昆明雌性小鼠,2月龄,运用D-半乳糖建立衰老小鼠模型并进行生物学鉴定后,采用免疫荧光和流式细胞术测定脾脏中巨噬细胞CD11b、树突状细胞CD11c、B淋巴细胞CD40的表达;采用免疫组化法测定脾脏组织Fas表达的改变。结果:模型组小鼠巨噬细胞CD11b+/MHC-Ⅱ+CD11b+的百分率为9.78±1.42,与对照组10.76±1.93相比下降(P<0.05);模型组小鼠树突状细胞CD11c+/MHC-Ⅱ+CD11c+、B淋巴细胞CD40+的百分率分别为5.34±0.74、43.60±8.06,与对照组7.88±1.73、56.70±10.97相比明显下降(P<0.01)。模型组小鼠脾脏组织Fas表达增加。结论:D-半乳糖所致衰老小鼠脾脏各种专职性抗原提呈细胞减少,脾脏组织Fas的表达出现渐进性增加。