登革病毒3型病毒样颗粒在酵母体内的表达与鉴定

目的 探讨登革病毒3型病毒样颗粒(DENV3-vLPs)的免疫原性.方法 用PCR法扩增登革病毒3型prME 基因,插入载体pGAPZaA构建重组质粒pGAPZaA-prME-D3,将其转化毕赤酵母X33构建转化子pGAPZaA-prME-D3/X33.对转化子表达上清和细胞裂解液进行SDS-PAGE和Western blotting分析.用蔗糖密度梯度离心纯化表达的DENV3-VLPs并进行鉴定和电镜观察.结果 成功构建重组载体pGAPZaA-prME-D3,获得酵母转化子pGAPZaA-prME-D3/X33,并应用毕赤酵母表达了DENV3-VLPs,表达蛋白约50 000 Mr,电镜观察vLPs直径为20～50 am.结论 应用酵母表达系统成功表达了DENV-3 VLPs,经鉴定表明其具有免疫反应性,为后续免疫原性研究及四价登革vLPs疫苗的构建奠定了基础.     

登革病毒1、2型单、双价病毒样颗粒的免疫原性研究

目的初步研究登革病毒1、2型单、双价病毒样颗粒（VLP）的免疫原性。方法表达纯化各型VLP。用纯化好的VLP免疫BALB／c小鼠,将BALB／c小鼠随机分PBS组、灭活DENV1、灭活DENV2、纯化VLP1、纯化VLP2、纯化VLP1＋2组,以灭活病毒为阳性对照,PBS为阴性对照。ELISA法检测小鼠血清抗vLP抗体效价以及血清IFN-1、TNF-α细胞因子水平,流式细胞术检测小鼠脾细胞CD4＋细胞和CD8＋细胞数。结果登革病毒1、2型单、双价VLP均能刺激免疫小鼠产生一定程度的抗血清效价,VLP1的抗体水平较VLP2的低,双价VLP组针对DENV2抗原的抗体水平上升明显,是单价VLP2的2-3倍;攻毒后。灭活DENV1和VLP2可以产生高水平的IFN-1,分别为60和35pg／ml,双价VLP组的较低;VLV2组的TNF-α一直保持较高水平,双价vLP组中攻DENV2组的TNF咀水平较DENVl组高;三次免疫后,各实验组较之PBS组CD4＋细胞的比例都有下降,而CD8＋细胞变化不大,除灭活DENV1组有增加,其余各组都有减少。结论无论单、双价VLP均能刺激小鼠产生一定程度的体液免疫和细胞免疫反应,联合免疫有一定程度的协同性。     

基于ＤＥＮＶ－ｐｒＭ／Ｅ基因构建ＤＥＮＶ－ＶＬＰ及其免疫学特性

摘 要：【目的】 构建和表达登革病毒４型病毒样颗粒,初步研究其免疫学特性。【方法】 用ＲＴ－ＰＣＲ法扩增ＤＥＮＶ４－ｐｒＭ／Ｅ基因,构建重组质粒ｐＧＡＰＺ－ｓｐｒＭ／Ｅ－Ｄ４,转化Ｘ３３酵母菌株,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ鉴定目的蛋白表达。切片电镜检测病毒样颗粒,蔗糖密度梯度离心纯化。免疫三组Ｂａｌｂ／Ｃ小鼠,每组１５只。采用间接ＥＬＩＳＡ检测抗原特异性抗体,间接免疫荧光法检测免疫血清与天然病毒粒子的结合,流式细胞术分析小鼠脾淋巴细胞表型,酶联免疫斑点法（ＥＬＩＳＰＯＴ）检测脾分泌ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α和ＩＬ－１０的细胞。【结果】重组质粒在酵母中以病毒样颗粒形式表达,为直径２０ ～ ３０ ｎｍ的球形颗粒,ＶＬＰ免疫组刺激小鼠产生抗体与灭活病毒组相似,流式及ＥＬＩＳＰＯＴ结果提示ＤＥＮＶ４－ＶＬＰ与灭活病毒组相似,用登革病毒抗原刺激后,分泌ＩＦＮ－γ,ＴＮＦ－α的细胞数目明显增加,各组分泌ＩＬ－１０细胞数目的整体水平均不高。【结论】应用毕赤酵母表达系统成功表达获得了ＤＥＮＶ４－ＶＬＰ,具有良好的免疫原性,可诱导Ｂａｌｂ／Ｃ小鼠产生有效的体液免疫应答,并能诱导Ｔｈ１型免疫应答而诱导Ｔｈ２型免疫应答较弱。     

登革病毒3型病毒样颗粒在酵母体内的表达与鉴定

目的探讨登革病毒3型病毒样颗粒（DENV3-VLPs）的免疫原性。方法用PCR法扩增登革病毒3型prME基因,插入载体pGAPZaA构建重组质粒pGAPZaA-prME-D3,将其转化毕赤酵母X33构建转化子pGAPZaA-prME-D3/X33。对转化子表达上清和细胞裂解液进行SDS-PAGE和Western blotting分析。用蔗糖密度梯度离心纯化表达的DENV3-VLPs并进行鉴定和电镜观察。结果成功构建重组载体pGAPZaA-prME-D3,获得酵母转化子pGAPZaA-prME-D3/X33,并应用毕赤酵母表达了DENV3-VLPs,表达蛋白约50000Mr,电镜观察VLPs直径为20～50nm。结论应用酵母表达系统成功表达了DENV-3VLPs,经鉴定表明其具有免疫反应性,为后续免疫原性研究及四价登革VLPs疫苗的构建奠定了基础。     

登革病毒1、2型单、双价病毒样颗粒的免疫原性研究

目的初步研究登革病毒1、2型单、双价病毒样颗粒(VLP)的免疫原性。方法表达纯化各型VLP,用纯化好的VLP免疫BALB/c小鼠,将BALB/c小鼠随机分PBS组、灭活DENV1、灭活DENV2、纯化VLP1、纯化VLP2、纯化VLP1+2组,以灭活病毒为阳性对照,PBS为阴性对照。ELISA法检测小鼠血清抗VLP抗体效价以及血清IFN-γ、TNF-α细胞因子水平,流式细胞术检测小鼠脾细胞CD4+细胞和CD8+细胞数。结果登革病毒1、2型单、双价VLP均能刺激免疫小鼠产生一定程度的抗血清效价,VLP1的抗体水平较VLP2的低,双价VLP组针对DENV2抗原的抗体水平上升明显,是单价VLP2的2～3倍;攻毒后,灭活DENV1和VLP2可以产生高水平的IFN-γ,分别为60和35pg/ml,双价VLP组的较低;VLP2组的TNF-α一直保持较高水平,双价VLP组中攻DENV2组的TNF-α水平较DENV1组高;三次免疫后,各实验组较之PBS组CD4+细胞的比例都有下降,而CD8+细胞变化不大,除灭活DENV1组有增加,其余各组都有减少。结论无论单、双价VLP均能刺激小鼠产生一定程度的体液免疫和细胞免疫反应,联合免疫有一定程度的协同性。