HCC特异性结合的scFv-AP融合蛋白的构建与表达

目的：构建与肝癌细胞特异性结合的单链抗体-AP融合蛋白，并诱导表达。方法：提取从大型人源噬菌体抗体库中筛选的含有与HCC特异性结合的scFv-10基因的质粒，用SfiⅠ、NotⅠ分别酶切，连接至经同样双酶切后的原核分泌型表达载体pDAP2上，转化和筛选后，阳性细菌经IPTG诱导表达，细胞ELISA鉴定融合蛋白活性。结果：重组质粒经PCR扩增，Eco91Ⅰ单酶切及Eco91Ⅰ／NotⅠ双酶切鉴定，证明scFv-10基因已插入到原核分泌型表达载体pDAP2上。表达产物的定位分析表明融合蛋白主要分泌性表达到周质腔，细胞ELISA证明表达产物有与HCC结合的活性。结论：成功地构建并表达了与HCC特异性结合的单链抗体．AP融合蛋白，为其应用奠定了基础。     

与肝癌细胞系HepG2特异性结合单链抗体的筛选与序列分析

目的：从人源噬菌体抗体库中筛选与肝癌细胞系HepC2特异性结合的单链抗体，为寻找肝癌细胞表面特异性标志及靶向研究奠定基础。方法：以正常肝细胞系L02为阴性筛选细胞，以肝癌细胞系HepG2为阳性筛选靶细胞，从人源噬菌体抗体库(Griflfin．l Library)经三轮筛选后，阳性菌质粒PCR确定其中含有单链抗体基因的克隆，通过细胞ELISA及FCM筛选特异性的单链抗体噬菌体，通过ABL3130全自动荧光测序仪测序，并通过GeneBank比对进行同源性分析，IPTG诱导可溶性单链抗体表达，并检测其与肝癌细胞株结合的特异性。结果：获得了2个特异性较高的阳性噬菌体单个克隆。经DNA测序后，在Genebank中与人的免疫球蛋白库进行比对，并用IMGTF／V-Quest软件进行分析，确定为2个插入序列不同的单链抗体片段。经细胞ELISA证明其阳性克隆菌培养上清可与肝癌细胞株特异性结合。获得的序列成功登陆Genebank，序列号为AY686498-AY686499。结论：从人源噬菌体抗体库中筛选到与肝癌细胞系HepG2特异性结合的具有功能活性的单链抗体，为进一步寻找肝癌细胞表面特异性抗原及靶向研究奠定了基础。