乳头瘤病毒重组减毒沙门菌疫苗的构建及诱导黏膜免疫的研究

乳头瘤病毒在生殖道黏膜增殖传播 ,与妇女生殖道黏膜检测不到HPVIgA抗体有关 ,因此诱导生殖道黏膜HPV特异性抗体对于防治HPV性传播性疾病具有重要的价值。本研究采用细菌内源性诱导启动子nirB ,以霍乱毒素CTA2B亚单位为黏膜免疫佐剂 ,构建HPV16重组减毒沙门菌疫苗pNir 16L1E7CTA2B ,研究其诱导黏膜免疫的能力。减毒沙门菌S .SL32 6 1为一种aroA基因突变株。在携带霍乱毒素CTA2B黏膜免疫佐剂基因载体pET CTA2B的基础上 ,将pUC 16L1E7中的HPV16L1E7经PCR和T A克隆技术插入pET CTA2B ,获得pET 16L1E7CTA2B。确定启…     

RP-HPLC测定桂龙咳喘宁胶囊中肉桂酸的含量

桂龙咳喘宁胶囊由桂枝、龙骨、半夏、黄连等药材加工制成,属于国家中药保护品种[1]。止咳化痰、降气平喘等功能。中药胶囊中制剂中桂枝为君药,其主要成分肉桂酸(cinnamicacid)具有抗菌、利胆、消炎、升白细胞等药理作用。为制剂质量标准,保证安全有效,本实验采用RP HPLC测定制剂中的肉桂酸含量。结果表明,本法简便、快速、灵敏、准确,可用于本品质量控制方法之一。1　仪器与试药日本岛津公司LC -6A型高效液相色谱仪,SPD -6AV型     

含变形链球菌PAcA基因的真核表达质粒pcDNA3.1-PAcA的构建与鉴定

目的 :构建含有免疫刺激序列、可防止变形链球菌在牙面粘附的DNA疫苗。方法 :利用PCR技术由质粒pPAcA CTA2 B扩增编码PAcA的DNA片段 ;通过T A克隆技术将目的DNA片段克隆于载体pMD1 8 T ,鉴定插入方向后 ,将目的DNA从载体上释放 ,再克隆于含有CpG免疫刺激序列的真核表达载体pcDNA3 .1 ,构建出用作防龋疫苗的真核表达质粒pcDNA3 .1 PAcA。结果 :通过对重组质粒pcDNA3 .1 PAcA进行酶切图谱和DNA序列测定分析 ,证明真核表达重组质粒pcDNA3 .1 PAcA构建成功、阅读框架正确。结论 :利用T A克隆等技术可成功将编码PAcA的DNA片段克隆到含有免疫刺激序列CpG的真核表达载体pcDNA3 .1 ,构建出真核表达重组质粒pcDNA3 .1 PAcA。     

携带双启动子DNA疫苗载体的减毒沙门菌在体内定植及动态变化

目的：探讨双启动子DNA疫苗载体在减毒沙门菌中的稳定性和重组减毒沙门菌在小鼠体内的定植及动态变化。方法：将人乳头瘤病毒双启动子DNA疫苗载体pCN-16L1E7转化减毒沙门菌S-SL3261，经口服、鼻饲和皮肤途径免疫小鼠，在免疫后的第3、4、5、6周取小鼠粘膜相关淋巴组织，电镜观察细菌在组织中的定植；组织匀浆，细菌培养计数确定细菌的增殖；从细菌中提取质粒酶切鉴定以确定质粒的稳定性。结果：重组减毒沙门菌S-SL3261能在小鼠脾脏、肝脏和粘膜相关淋巴组织中定植，电镜可检测到多个细菌定植灶；重组减毒沙门菌可有效进入机体细胞并有限增殖达6周，在第4～5周菌落数量达到高峰，然后逐渐减少以至最后被清除。pCN-16L1E7可在减毒沙门菌中稳定存在，载体的产量和酶切图谱没有明显变化。结论：双启动子DNA疫苗载体pCN-16L1E7与减毒沙门菌有较好的相容性，能够在小鼠体内定植及有限增殖。口服、鼻饲和皮肤粘膜接种途径均可有效地将减毒沙门菌携带的DNA疫苗载体导入粘膜相关淋巴组织。     

减毒沙门氏细菌为载体的人乳头瘤病毒双启动子DNA疫苗载体构建

目的 :构建一种廉价高效的防治宫颈癌的人乳头瘤病毒新型双启动子DNA疫苗。方法 :设计合成细菌厌氧诱导启动子Nir ,含有FNR顺式反应元件、RBS和真核基因Kozak元件 ,插入pTriEx真核启动子CMVIE下游 ,构建pCMVnir双启动子载体。将人乳头瘤病毒 16型L1L7,融合基因 ,插入pCMVnir,制备pCMVnirL1E7,转化减毒沙门氏细菌SL32 6 1,厌氧诱导表达 ,SDS PAGE和Westernblot分析检测Nir启动子的活性。结果 :经DNA序列和限制性内切酶鉴定分析 ,成功构建了HPV双启动子DNA疫苗载体pCMVnirL1E7,转化沙门氏细菌SL32 6 1,厌氧条件下可诱导表达HPVL1E7蛋白质。结论 :成功构建了一种与胞内寄生细菌(减毒沙门氏细菌 )匹配的双启动子DNA疫苗新型载体 ,并构建了HPV16pCMVnirL1E7新型DNA疫苗     

HPV16L1E7的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的：研究人乳头瘤病毒(HPV)的主要衣壳蛋白L1和主要的转化蛋白E7的融合基因在原核细胞中的表达，为研制HPVl6L1E7疫苗和诊断试剂盒提供依据。方法：采用聚合酶链反应(PCR)以重组质粒pUCl9UE7为模板扩增HPVl6L1E7基因片段，克隆至载体pMDl8-T中，并用限制性内切酶将HPVl6L1E7基因切下，克隆至原核表达质粒pQE30中，经IPTG诱导表达，再使用SDS-PAGE和蛋白印迹检测其抗原性和表达水平。结果：HPVl6L1E7融合蛋白能被抗HPVl6L1抗体识别，分子量为66KD，经IPTG诱导4h后，表达的HPVl6L1E7融合蛋白占菌体总蛋白量的25％以上。结论：成功构建的表达载体pOE30-L1E7可在原核表达细胞中高效表达，且表达出的HPVl6L1E7融合蛋白具有反应活性，可与HPVl6抗体发生反应。     

新型双启动子表达质粒pCMVnir的构建及其促进基因免疫效果的研究

目的 构建一种新型双启动子表达载体pCMVnir，研究其与胞内寄生菌联合应用促进基因免疫效果的作用。方法细菌硝酸盐还原酶基因B启动子nirB为厌氧诱导启动子，根据nirB启动子的结构，设计合成改良的nirB，置换三启动子载体pTriEx-4中的T7Lac和P10启动子，而保留其CMVie启动子，获得携带CMVie和nirB双种启动子的新型载体pCMVnir，或称为pCN。构建pCN-EGFP和pCN-DsRed两种报告质粒，分别转化S．SL3261、E．coil DH-15a和CHO等细胞，检测报告基因的表达情况以确定两种启动子的活性。pCN-EGFP转化S．SL3261，接种BALB／c小鼠，定期解剖小鼠收集黏膜相关淋巴组织，观察重组细菌和载体DNA在细胞中的定植及稳定性。免疫接种小鼠，并定期收集小鼠血清和阴道分泌物，以重组rEGFP为抗原，用EEISA方法研究其增强免疫应答的能力。并构建人乳头瘤病毒L1E7双启动子pCN-16L1E7及对照单启动子载体pCMV-16L1E7和pNir-16L1E7，对比三者涛导黏膜免疫的差别。结果双启动子表达载体pCMVnir可在细菌和真核细胞中有效表达报告基因，在细菌中可形成肉眼可见的荧光菌落和沉淀，转染CHO等真核细胞能够表达荧光蛋白，表明pC-MVnir载体的两种启动子都有活性，其中nirB活性是受兼性厌氧调控的。pCMVnir与细菌有较好的相容性，重组细菌可在动物体内有限复制和定植达6周，质粒可在细菌中稳定存在。以rEGFP为抗原检测发现pCN-EGFP诱导的免疫反应高于常用的单启动子载体pCMV-EGFP。人乳头瘤病毒双启动子载体pCN-16L1E7诱导的免疫反应也高于其他单启动子载体。结论双启动子表达载体pcMVnir与减毒胞内寄生菌匹配应用，能够提高抗原表达量及增强基因免疫反应的强度。并可作为一般基因克隆和表达载体，特别是作为原核表达载体，不用添加诱导物，即可获得大量表达。     

含有弓形虫表面抗原P22、P30复合基因的载体构建

目的　选择弓形虫表面抗原P2 2、P30的有效基因片段 ,共同构建在同一克隆载体pUC19和表达载体 pGE MEXTM- 1上 ,并保证其连接方向及开放读码框的正确。方法　根据已发表P30基因序列 ,用PCR技术调取所需基因片段 ,P2 2基因片段来自重组质粒pGEX - 2T -v2 2 ,将两片段定向克隆于克隆载体 pUC19及表达质粒pGEMEXTM- 1上 ,用酶切及测序的方法对重组子进行鉴定。结果　酶切产物经电泳显示条带清晰 ,P2 2、P30基因片段的泳动位置分别在 4 4 6bp和 86 0bp的位置 ,与预计结果一致 ;测序结果表明插入的复合基因片段方向及序列均正确。结论　成功构建的含有P2 2、P30基因片段的质粒重组体 ,保证了两基因连接方向、序列及开放读码框的正确 ,为今后两基因的进一步复合表达研究奠定了基础。     

人ODC重组蛋白及其多抗的制备和临床应用

目的:构建鸟氨酸脱羧酶(ODC)表达载体,表达ODC重组蛋白,制备其多克隆抗体并观察其在大肠癌诊断中的意义.方法:从大肠癌组织中提取总RNA,反转录PCR法扩增全长ODC cDNA,将扩增的基因插入表达载体pQE-30的BamH Ⅰ和Sal Ⅰ酶切位点之间,DNA测序验证插入片段.将重组载体转化入宿主菌M15中进行诱导表达,产生含6-His-tag的融合蛋白.Western Blotting法检测表达蛋白.亲和层析法纯化融合蛋白,以该蛋白免疫小鼠制备多抗,免疫组化检测大肠癌组织中ODC的表达水平.结果:酶切鉴定和DNA测序显示ODC重组表达载体中含有人ODC eDNA全长序列,与NIH基因库的人ODCcDNA比较有99%的同源性.将该重组载体转化入大肠杆菌M15中表达所得蛋白经Western Blotting验证为目的蛋白.纯化融合蛋白,免疫小鼠获得多抗效价较高.免疫组化检测大肠癌组织中ODC的表达显示该抗体检测效果较好,大肠癌组织中ODC的表达水平明显高于正常组织(P＜o.05).结论:成功地构建了ODC表达载体、表达出ODC重组蛋白、制备出ODC多克隆抗体,为进一步研究结直肠癌的发病机理及其诊断和治疗方法打下了良好基础.