女性A型血友病FⅧ基因突变分析

报道罕见的女性A型血友病1例,并对其凝血因子Ⅶ进行基因突变分析。患者,女,65岁,因为跌倒后右胸痛2d入院,院内查体提示胸壁皮下血肿,双下肢等长,髋屈曲及内旋受限。测定凝血指标提示APTT61．3s,正常血浆纠正后为41．3s,而PT、FIB、TT均正常。有既往出血史。FⅧ活性为2％,FⅨ活性为200％,vWF：Ag为120％,vWF：RCof100％,vWF：CBAl28％,FⅧ结合分析正常;髋关节X片提示;双侧髋臼发育不良,髋关节骨关节炎。临床诊断为血友病A型。提取该患者外周血DNA,根据NM_000132之凝血因子FⅦ基因序列设计合成了其第14外显子特异的引物,行聚合酶链反应扩增,并对扩增产物进行测序分析,测序结果与标准序列进行比较,发现该患者出现4111A→C杂合突变,使1314位氨基酸由苏氨酸变为脯氨酸,产生一错意突变,该突变未见其它文献报道．     

绿色荧光蛋白标记的大鼠胶质细胞源性神经营养因子重组腺病毒载体的构建及其表达

目的：构建大鼠胶质细胞源性神经营养因子基因的重组腺病毒并观察其在神经干细胞上的表达，探索胶质细胞源性神经营养因子作为基因治疗神经病变的价值。方法：实验于2004-8／12在四川大学华西医院眼疾病分子遗传实验室进行。以新生SD大鼠大脑皮层细胞RNA为模板，反转录聚合酶链反应扩增出全长的胶质细胞源性神经营养因子基因，经测序验证后，亚克隆至穿梭质粒pAdTrack CMV中，与骨架质粒pAdEasy 1同源重组为腺病毒载体。线形化后转染293细胞进行包装扩增，利用AdEasy 1系统上的绿色荧光蛋白鉴定病毒表达，并用病毒上清转化大鼠神经干细胞，检测胶质细胞源性神经营养因子基因的表达。结果：①胶质细胞源性神经营养因子基因扩增后进行测序显示扩增片段为653bp个核苷酸，同源性比较该序列正确。②重组腺病毒载体经酶切验证为阳性克隆，转染293细胞包装后的病毒滴度为lxl09PFU／mL。③转入胶质细胞源性神经营养因子的重组腺病毒的神经干细胞扩增出653bp的带。结论：成功构建了胶质细胞源性神经营养因子重组腺病毒并见其在大鼠神经干细胞中进行了表达。     

人TCP11L2和鼠Tcp1112基因的定位及表达的初步研究

目的观察人TCP11L2和鼠Tcp1112基因在细胞中的表达及定位和Tcp1112基因的表达谱研究。方法用RT-PCR法从正常人和鼠睾丸组织中分别扩增得到人TCP11L2基因和鼠Tcp1112基因的开放读码框全长cDNA并定向克隆到真核表达载体pEGFP-N1质粒中,构建了pEGFP-TCP11L2和pEGFP-Tcp1112融合基因表达载体,然后以脂质体介导转入MDCK细胞中,荧光显微镜下观察融合基因的表达情况;RT-PCR检测鼠Tcp1112基因在组织中的表达情况。结果在转染重组真核表达载体pEGFP-TCP11L2、pEGFP-Tcp1112的MDCK细胞中,荧光主要集中在细胞核外区域,而在转染空白载体pEGFP-N1的细胞中,荧光布满整个细胞;RT-PCR检测鼠Tcp1112为多组织表达。结论人TCP11L2和鼠Tcp1112蛋白能在MDCK细胞中高效表达,表达的蛋白定位在细胞核外区域,鼠Tcp1112的多组织表达提示该基因与鼠Tcp11基因功能的不同。     

绿色荧光蛋白标记的大鼠胶质细胞源性神经营养因子重组腺病毒载体的构建及其表达

目的:构建大鼠胶质细胞源性神经营养因子基因的重组腺病毒并观察其在神经干细胞上的表达,探索胶质细胞源性神经营养因子作为基因治疗神经病变的价值。方法:实验于2004-8/12在四川大学华西医院眼疾病分子遗传实验室进行。以新生SD大鼠大脑皮层细胞RNA为模板,反转录聚合酶链反应扩增出全长的胶质细胞源性神经营养因子基因,经测序验证后,亚克隆至穿梭质粒pAdTrackCMV中,与骨架质粒pAdEasy1同源重组为腺病毒载体。线形化后转染293细胞进行包装扩增,利用AdEasy1系统上的绿色荧光蛋白鉴定病毒表达,并用病毒上清转化大鼠神经干细胞,检测胶质细胞源性神经营养因子基因的表达。结果:①胶质细胞源性神经营养因子基因扩增后进行测序显示扩增片段为653bp个核苷酸,同源性比较该序列正确。②重组腺病毒载体经酶切验证为阳性克隆,转染293细胞包装后的病毒滴度为1x109PFU/mL。③转入胶质细胞源性神经营养因子的重组腺病毒的神经干细胞扩增出653bp的带。结论:成功构建了胶质细胞源性神经营养因子重组腺病毒并见其在大鼠神经干细胞中进行了表达。     

HSF4基因突变导致常染色体显性遗传核性白内障

目的 鉴定一个延续5代常染色体显性遗传核性白内障家系的致病基因。方法 根据已知先天性白内障致病基因在染色体上的定位，选择了D16S539分子标记，对该家系进行连锁分析，通过基因测序鉴定致病基因。结果 该69名家系成员中有16例患有先天性核性白内障，致病基因定位于16q21-q22，并在候选基因HSF4外显子3检测到一新的突变杂合子134456G-A，该突变导致112E的同义突变，而在家系正常成员中则未检测到该突变。结论 该家系核性白内障表型很可能系由HSF4基因134456G-A突变所致，且此突变尚未见报道。     

小鼠Boule蛋白与Crem3′UTR结合并调节其表达

目的研究小鼠Boule蛋白与精子成熟相关基因Crem之间的相互作用,揭示Boule蛋白在精子发生过程中所起的作用。方法构建pGEX-Boule表达载体,将表达载体转化宿主菌(BL21)感受态细胞,诱导纯化出Boule蛋白,应用RT-PCR和凝胶滞后实验(EMSA)分析与Boule蛋白结合的mRNA。结果表达载体pGEX-Boule构建成功,纯化出GST-Boule融合蛋白,RT-PCR和EMSA实验证明Boule蛋白能够结合Crem3′UTR。结论 Boule蛋白能够结合Crem3′UTR,可能通过调控Crem蛋白的表达作用于精子发生过程。     

应用竞争性荧光定量聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒DNA

目的:建立竞争性荧光定量聚合酶链反应(CFQ-PCR),并探讨CFQ-PCR在乙型肝炎病毒(HBV)临床检测中的意义.方法:根据HBV病毒adr亚型基因组序列合成一对HBV特异的引物,和一条特异的TaqMan探针;根据上述引物序列,采用分子克隆技术制备内对照DNA;再根据内对照序列合成一条内对照DNA特异的与上述TaqMan探针不同标记的TaqMan探针;将适量的内对照DNA加入到PCR反应体系中,使其与HBV靶序列共扩增.结果:在30μL CFQ-PCR反应体系中,加入约20拷贝内对照DNA能够稳定地获得共扩增曲线;经琼脂糖凝胶电泳分析,加入约100-500拷贝内对照DNA能够有效地获得共扩增产物条带信号;在210个临床HBsAg阳性血清标本的CFQ-PCR扩增中识别出8个未能有效扩增的标本,60份HBsAg阴性血清标本中识别出2个内对照未能有效扩增的标本,后经DNA纯化处理,上述全部标本的内对照均获得阳性扩增结果,其中有7个HBsAg阳性血清标本获得HBV DNA扩增阳性结果.结论:CFQ-PCR能够有效地提示临床标本HBV DNA体外扩增时由于扩增失败导致的假阴性,适合临床推广应用.     

人TCPllL2和鼠Tcp1112基因的定位及表达的初步研究

目的 观察人TCP11L2和鼠Tcp1112基因在细胞中的表达及定位和Tcp1112基因的表达谱研究.方法 用RT-PCR法从正常人和鼠睾丸组织中分别扩增得到人TCP11L2基因和鼠Tcp1112基因的开放读码框全长cDNA并定向克隆到真核表达载体pEGFP-N1质粒中,构建了pEGFP-TCP11L2和pECFP-TcP1112融合基因表达载体,然后以脂质体介导转入MDCK细胞中,荧光显微镜下观察融合基因的表达情况;RT-PCR检测鼠Tcp1112基因在组织中的表达情况.结果 在转染重组真核表达栽体pEGFP-TCPllL2、pECFP-Tcp1112的MDCK细胞中,荧光主要集中在细胞核外区域,而在转染空白载体pECFP-N1的细胞中,荧光布满整个细胞;RT-PCR检测鼠Tcp1112为多组织表达.结论 人TCP11L2和鼠Tcp1112蛋白能在MDCK细胞中高效表达,表达的蛋白定位在细胞核外区域,鼠Tcp1112的多组织表达提示该基因与鼠Tcp11基因功能的不同.     

KH902抑制猴激光致脉络膜新生血管

目的 血管内皮细胞生长因子（VEGF）在视网膜新生血管发生中起着核心而关键的作用。有证据表明，VEGF在老年黄斑变性（AMD）的脉络膜新生血管发生中也是一个重要的刺激因子。复明肽（KH902）是成都康弘生物科技有限公司提供的人源化的抗体样VEGF捕获蛋白，与VEGF有着较高亲和力，因此被认为能够抑制新生血管的形成。本研究的目的在于观察通过玻璃体腔注射KH902，是否能够有效抑制激光致恒河猴脉络膜新生血管的产生和生成。方法采用VISULAS532S固体激光器以240mW，50m8进行激光眼底照射恒河猴双眼Bruch膜和覆盖其眼上的视网膜色素上皮，击穿Bruch膜，每眼烧出5—9个直径约50pm损伤点。然后经玻璃体内注射复明肽（640pg／眼；n=4眼／组）或等体积PBS，每周注射1次。3周后行眼底血管荧光造影，观察并记录激光斑荧光渗漏情况并采用SPSS10．0软件进行统计学分析。结果 在注射PBS的对照组，有48％（12／25。4眼）的激光损伤斑出现强荧光渗漏，而复明肽给药组，仅有8％（2／24，4眼）的激光损伤斑发现有荧光渗漏，且有渗漏非常轻微，未发现强荧光渗漏，两组差异具有显著性（P〈0．05）。结论该研究显示，复明肽（KH902）具有强烈抑制激光致恒河猴脉络膜新生血管的作用，提示其在治疗新生血管性AMD的方面具有很好的临床廊用前景。     

zili在斑马鱼早期胚胎发育胚层分化中作用的初步研究

目的 探讨斑马鱼胚胎发育早期,piwil2基因(zili)对外胚层、中胚层、内胚层分化的影响.方法 设计并合成zili-MO和zili-cMO两条吗啡啉修饰的反义核苷酸,构建zili基因的表达载体并体外合成mRNA.制备外、中、内胚层标志基因(gsc、eve1、sox17)的反义RNA探针.对单细胞期胚胎分别进行显微注射zili-MO、zili-cMO或zili mRNA,采用整胚原位杂交技术检测标志基因的表达变化.结果 整胚原位杂交检测结果表明,在注射了zili-MO后zili表达下调,外胚层及中胚层标志基因gsc的表达减弱.外胚层标志基因eve1的表达增强,表达sox17基因的内胚层细胞数量减少.在注射了zili mRNA后zili表达上调,外胚层及中胚层标志基因gsc的表达增强,外胚层标志基因evel的表达减弱,表达sox17基因的内胚层细胞数量减少.结论 zili在胚胎发育早期对外胚层、中胚层、内胚层的分化均起到了一定的作用,而且对于维持正常胚胎发育也具有重要作用.