hEGF和hbFGF的C端(78-154aa)融合蛋白的表达、纯化及活性测定

目的:将人表皮生长因子(hEGF)与人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF)的C端连接,构建出既可与肝素结合,又具有促进细胞生长活性的融合蛋白,并在大肠杆菌中高效表达。方法:将PCR扩增hEGF全基因与PCR扩增hbFGF5端的231bp的片段连接,克隆到表达载体pJN,构建出含融合基因的表达质粒pJRH。将pJRH转化BL21(DE3)表达菌株,获得融合蛋白的表达菌株pJRH(BL)。Westernblot检测表达产物免疫学活性。表达产物上肝素亲和柱和分子筛进行纯化。结果:融合蛋白表达产量为30%,融合蛋白不仅能与肝素结合,而且具有促细胞增殖的活性。Westernblot检测结果显示融合蛋白有EGF的免疫活性。融合蛋白的等电点为5.2。结论:本研究构建了一个hEGF和hbFGF的C端的融合蛋白,该蛋白基本保持了两者原有的生物活性。作为一个新的活性因子,本研究为探讨活性因子蛋白结构与功能的关系奠定基础。     

重编程诱导多功能干细胞的研究进展

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have been first induced from mouse fibroblasts since 2006, and the research on iPSCs has made great progress in the following years. iPS cell lines were established from different somatic cells through DNA, RNA, protein, and small molecule compounds and various methods of transduction, making the induction of iPSCs more secure and effective, and more attractive prospect of clinical application. In this review, different somatic cell reprogramming, different levels of reprogramming, different transduction pathways, and prospect of application are discussed.     

Maxadilan对诱导多能干细胞增殖的作用

目的: 探讨垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)的PAC1受体特异激动剂maxadilan对人诱导多能干细胞(IPSCs)增殖的作用。方法: 培养人IPSCs,利用RT-PCR和Western blotting检测IPSCs的PAC1受体;IPSCs培养基中加入不同浓度的maxadilan作为实验组,未加入maxadilan作为对照组。CCK-8法检测maxadilan对IPSCs增殖的影响;流式细胞仪分析maxadilan对细胞周期的影响;染色体核型分析检测maxadilan对IPSCs核型的影响;real-time-qPCR和免疫荧光法从基因及蛋白水平检测maxadilan对IPSCs的多能性基因 Nanog和OCT4 的影响;real-time qPCR检测maxadilan对IPSCs及其形成胚体细胞的 Nestin和PAX6 基因的影响;RT-PCR检测maxadilan对IPSCs分化为三胚层能力的影响。结果: RT-PCR和Western blotting均显示IPSCs含有PAC1受体;CCK-8法显示100 nmol/L maxadilan组比对照组细胞增多16% (P＜0.05);流式细胞仪分析显示孵育100 nmol/L maxadilan 3 h、6 h和9 h后IPSCs增殖指数为47.23%、59.70%、55.67%,与对照组37.00%相比,差异显著(P＜0.05);染色体核型分析显示maxadilan处理过的IPSCs核型正常;RT-PCR、real-time qPCR和免疫荧光法显示maxadilan未影响IPSCs多能性。结论: 人IPSCs存在PAC1受体,maxadilan对人IPSCs具有促进细胞增殖作用且没有影响IPSCs的多能性和染色体核型。     

利用基因芯片研究六味地黄丸对老年大鼠基因表达的影响

目的:利用基因芯片研究六味地黄丸对老年大鼠基因表达的影响。方法:将40只20月龄SD雄性大鼠分成不用药与用六味地黄丸两组,用药5周后,通过检测相关生化指标,确定用药组与对照组之间具显著差异。提取20只4月龄SD雄性大鼠脾脏mRNA,平均分成两组,分别与老年用药组脾脏mRNA和老年对照组脾脏mRNA配对进行逆转录和芯片杂交实验,获得老年对照组和老年用药组分别和青年组相比,相关基因表达水平的差异,通过比较两组数据,评价六味地黄丸对与衰老相关的基因表达的调节作用。结果:芯片结果显示老年对照组与青年组相比有13个基因表达显著下调,1个基因表达显著上调。而在老年用药组中,14个相关基因的表达水平没有明显变化;而另有2序列与青年组相比表达显著上调。结论:通过基因芯片技术,发现16个基因的表达水平可受六味地黄丸用药的影响。通过深入研究对我们深入理解六味地黄丸抗衰老的分子机制可能有帮助。     

由BMP-4基因转入C2C12细胞引起的成肌细胞到成骨细胞的表型转变

目的:研究BMP-4基因对C2C12细胞分化的影响。方法:BMP-4基因在pCI-neo质粒中构建后转入C2C12细胞。转入pCI-neo-BMP-4重组质粒的细胞、转入pCI-neo质粒的细胞及没有转染的细胞在相同的条件下培养。结果:转入pCI-neo质粒的细胞及没有转染的细胞在增殖期和分化期均不表达BMP-4,在未分化期表现为典型的星形形态,并相互融合成细长而多核的肌小管。而转入pCI-neo-BMP-4重组质粒的细胞在增殖期和分化期均大量表达BMP-4,形态上不形成肌小管,而是形成类似成骨细胞的形态,并高水平表达碱性磷酸酶、在培养基中分泌骨钙素。结论:表明将BMP-4基因转入C2C12细胞可改变其肌源的分化途径,而分化为成骨细胞系,且这种分化转向是基因水平上的。     

带有穿膜肽PTD的重组Oct4的制备及活性鉴定

目的: 重组蛋白构建细胞转录因子PTD-Oct4。方法: 利用重叠延伸PCR法重组目的基因构建质粒pKYB-PTD-Oct4,并转染至E.coli ER2566。 镍柱纯化重组蛋白并用Western bloting对其进行鉴定。用异硫氰酸荧光素(FITC)标记PTD-Oct4,检测其穿透中国仓鼠卵巢(CHO)细胞膜的能力;用荧光共振能量转移(FRET)检测重组融合蛋白PTD-Oct4结合目的DNA的活性。结果: 成功获得目的蛋白PTD-Oct4,其可以成功进入细胞,定位于细胞核内,穿膜效率为(28.3±2.4)%,并具有与目标DNA序列特异结合的能力。结论: 制备重组PTD-Oct4为外源蛋白诱导多能干细胞(IPSCs)奠定基础。     

纳豆激酶酶原基因的克隆、融合表达及活性测定

目的:利用基因工程技术, 构建表达具溶栓活性的纳豆激酶的大肠杆菌工程菌。方法:利用PCR方法扩增纳豆激酶酶原(pro-NK)基因, 并克隆到表达载体pET3c上, 构建表达pro-NK和载体上22氨基酸短肽的融合蛋白的表达质粒pENK;表达质粒pENK分别转化溶源化宿主菌BL21(DE3)pLysS^-和BL21(DE3)pLysS⁺, 获得表达菌pENK-(DE3)pLysS^-和pENK-(DE3)pLysS⁺。利用SDS-PAGE和纤维蛋白平板法检测目的蛋白的表达及活性。结果:SDS-PAGE显示两株菌株均表达42kD的目的蛋白。纤维蛋白平板法显示表达产物具溶栓的活性。在pENK-(DE3)pLysS^-中融合蛋白不需异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导就有基础表达, 融合蛋白的表达使表达菌细胞溶解, 菌落中空, 表明表达产物具细胞毒作用。结论:本研究成功实现了在大肠杆菌表达具有溶栓活性的pro-NK融合蛋白, 为开发纳豆激酶成为新一代溶栓药物的研究奠定基础。     

基因芯片研究与衰老相关免疫基因的表达

目的:利用基因表达谱芯片,研究免疫相关基因在衰老过程中表达水平的改变。方法:分别提取20只20月龄SD大鼠和20只4月龄SD大鼠的脾脏mRNA,并通过逆转录制备成杂交探针;老年大鼠用Cy5d-UTP标记,青年大鼠用Cy3 d-UTP标记。将两种探针等量混合后与包含416个免疫相关基因的cDNA芯片进行杂交。通过扫描仪扫描芯片荧光信号和计算机分析,比较老年组和青年组大鼠脾脏的基因表达水平的差异。同步检测老年组大鼠和青年组大鼠的心、肝、肾和血液中的与自由基相关的生化指标。结果:生化指标检测证实20月龄老年大鼠与4月龄青年大鼠清除自由基的能力有显著的差异,说明其生理机能有显著差异,适用于芯片的研究。而芯片结果显示在所研究与免疫相关的基因中,13个基因在老年大鼠脾脏中表达下调,其中包括参与应激和免疫应答的基因,部分参与细胞增殖、分化的调节基因和参与DNA/RNA修复基因;只有1个基因,即编码良性肿瘤淀粉酶的基因在老年大鼠脾脏中表达特异增高。结论:运用基因表达谱芯片可以帮助我们了解免疫系统在衰老过程中的变化,深入理解衰老的发生和发展机制。     

重组蛋白PTD-HSP27的制备及其穿细胞膜和角膜组织的功能研究

目的:制备PTD-HSP27蛋白并研究其能否穿过人晶状体上皮细胞SRA01/04细胞膜及新西兰大白兔的角膜组织进入眼前房。方法:利用重叠延伸PCR法获得重组目的基因片段PTD-HSPB1-6His,构建重组质粒p KYB-PTD-HSP27-6His,原核诱导PTD-HSP27蛋白表达及纯化重组蛋白后对其进行Western blotting鉴定;用异硫氰酸荧光素(FITC)标记重组蛋白PTD-HSP27并检测其穿透SRA01/04细胞膜的能力及兔眼角膜组织的能力。结果:成功构建并纯化制备目的蛋白PTD-HSP27,在PTD-HSP27孵育后的SRA01/04细胞及结膜囊滴注PTDHSP27兔眼前房内均可检测出重组蛋白PTD-HSP27。结论:通过重叠延伸PCR法及镍柱层析纯化法可以获得较纯的重组蛋白PTD-HSP27;重组蛋白PTD-HSP27能够穿透SRA01/04细胞膜及穿越兔眼角膜进入房水。     

小环肽CHSDGIC对兔角膜碱烧伤愈合的作用

目的研究垂体腺苷酸环化酶激活多肽衍生的小环肽CHSDGIC对兔角膜碱烧伤愈合的促进作用,为临床治疗提供新思路。方法制作兔角膜碱烧伤模型。14只新西兰大白兔随机平均分为2组:一组为实验组,碱烧伤后给予小环肽滴眼液滴眼(100μmol.L-1),每天3次,持续21d;另一组为对照组给予生理盐水滴眼。碱烧伤后每天观察眼前段情况,在不同的时间点(碱烧伤后第2、7、14、21天)通过角膜荧光素染色测量角膜着色面积,并在治疗结束后进行角膜组织学检查。结果角膜碱烧伤后在不同时间点(第2、7、14、21天)测量的角膜荧光素染色面积,实验组分别为(1.85±0.10)mm2、(4.56±0.22)mm2、(3.39±0.13)mm2、(0.44±0.10)mm2;对照组分别为(2.33±0.15)mm2、(6.80±0.26)mm2、(9.09±0.24)mm2、(5.03±0.24)mm2,两组之间差异均有统计学意义(均为P<0.05)。HE染色检查发现实验组角膜上皮修复较完整,基质层未见明显炎症细胞及少量血管内皮细胞。对照组角膜上皮与基底部结合疏松,可见明显炎性细胞。结论小环肽CHSDGIC能促进碱烧伤后角膜上皮的修复,可能成为恢复角膜完整性及透明性的极有潜力的治疗药物。