慢性白血病抗原CML28 HLA-A*0201限制性CTL表位预测

目的鉴定慢性白血病肿瘤抗原CML28的HIA-A*0201限制性CTL表位。方法 采用超基序和量化基序结合的方法初步预测CM128的HLA-A*0201限制性CTL表位；利用T2细胞亲合力实验初步验证预测结果。结果 在预测的4个候选CTL表位中，ALVDAGVPM和ALDSDGTLV有较高的亲和力，ALFCGVACA和SLLACCLNA仅有低度亲和力。结论ALVDAGVPM与ALDSDGTLV最有可能是慢性白血病肿瘤抗原CML28的HLA-A*0201限制性CTL表位。     

体外转录制备的siRNAs对SARS-CoV复制的抑制作用

目的体外研究针对SARS-CoV RNA依赖性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase,RdRp）的小干扰RNA（Small interference RNA,siRNA）对SARS-CoV感染的抑制效应。方法利用Ambion公司在线设计工具,设计出4条针对RdRp基因的siRNAs,并在体外利用试剂盒进行转录合成。在SARS-CoV感染前1d,将这4条体外转录的siRNAs用Lipofectamine 2000试剂转染入Vero E6细胞中。感染后,每天观察感染细胞的细胞病变效应（Cytopathic effect,CPE）。第5天,用空斑形成实验（Plaque formation unit,PFU）检测感染细胞培养上清液中SARS-CoV滴度。结果CPE结果显示,在感染后的前4d,各siRNAs均能有效地保护细胞免受感染;在第5天,4条siRNAs中有3条仍能有效保护细胞不被感染。PFU实验结果显示,在第5天,所有siRNAs转染的细胞培养上清液中,SARS-CoV的滴度均显著低于阳性对照（P〈0．001）。结论实验结果表明针对SARS-CoV的RdRp基因的siRNAs能有效而特异地抑制该病毒在哺乳动物细胞中的复制和繁殖,提示如果应用合适的给药途径,RNAi策略可以用于体内抑制SARS-CoV的感染。     

RNA干扰能有效抑制SARS相关冠状病毒复制

基于RNA干扰可抑制HIV等病毒的事实[1],本课题组构建了针对SARS病毒的、能表达小发夹结构RNA的siRNA质粒,利用RNA干扰有效抑制了该病毒的复制.     

质粒表达型siRNA对SARS-CoV复制与感染干扰的初步研究

目的构建针对SARS-CoV的特异性siRNA质粒,利用RNA干扰技术抑制该病毒复制与感染.方法根据SARS-CoV的全长基因序列,以4个不同的部位为靶点,分别设计、合成含有19 nt干扰序列的一段寡核苷酸,将两两互补的寡核苷酸经退火后所形成的序列克隆到pSilencer 3.1-H1载体中,构建表达siRNA的质粒.采用脂质体法将质粒转染Vero E6细胞,经潮霉素抗性筛选后,再对稳定表达的细胞进行细胞病变、病毒空斑形成和MTT实验,以观察干扰效应.结果对所构建的质粒分别测序,确定其含有siRNA的序列与预期的特异性干扰序列一致.用不同浓度的SARS-CoV感染转染质粒后的细胞,与阴性对照相比,其细胞病变减轻、活细胞显著增加,病毒空斑明显减少.结论利用RNA干扰能有效的抑制SARS-CoV在细胞中的复制,并对细胞有保护作用,为预防、治疗SARS提供了新的思路和方法.     

基于α-病毒复制酶的基因疫苗对人黑色素瘤的免疫作用

目的研究基于α-病毒复制酶的人黑色素瘤基因疫苗免疫学作用.方法建立及鉴定人/鼠嵌合模型(trimera),将基于α-病毒复制酶的mage-3基因疫苗免疫动物,检测动物体内特异抗体滴度;用标准4 h51Cr释放实验检测动物体内特异CTL活性.结果FACS分析显示,trimera小鼠腹腔细胞中人白细胞占总细胞的88.84%,脾脏细胞中人白细胞的比例占57%,同国外文献报道一致.基于α-病毒复制酶的重组基因疫苗mage-3/pSMART2a对trimera小鼠免疫后,小鼠腹腔细胞的CTL在效靶比为100:l时杀伤率达到70%左右,此时的对照组mage-3/pCI-neo组最大杀伤率为40%左右.ELISA结果显示,重组基因疫苗mage-3/pSMART2a组产生的mage-3抗原特异性抗体效价达到1:512,mage-3/pCI-neo组为1:256.结论成功建立了人/鼠嵌合模型,并在动物体内激发出针对人黑色素瘤基因疫苗的初次免疫应答.     

血清肿瘤标志物TSGF、CEA和CA199联检对大肠癌的诊断价值探讨

目的探讨血清肿瘤标志物TSGF、CEA和CA199联检对大肠癌的诊断价值。方法对40例大肠癌患者进行TSGF、CEA和CA199单项检测和联合检测,对检测结果进行分析。结果单项检测中TSGF准确度最高;联合检测准确度要好于单项检测。结论在血液检测的水平上,TSGF、CEA和CA199联合检测比单项检测效果相对要好,能较好的提高大肠癌患者的确诊率,从而为临床治疗提供合理的参考,为及时救治患者赢得有利时机,因此值得在临床上应用和推广。     

SSX基因家族研究进展

SSX基因家族由9个成员组成，其中SSX-1、SSX-2和SSX-4经常出现在滑膜肉瘤t(X：18)染色体易位的SYT-SSX融合基因中。SSX基因家族可编码肿瘤，睾丸抗原，在睾丸以外的正常组织中，除甲状腺微弱表达外，没有发现它们的存在。HOM-MEL-40是最早用重组cDNA表达库血清学分析技术确定的由SSX-2基因表达的抗原。近来的研究发现蛋白SSX-2 41-49是CD8^ ctl免疫识别的优势表位，而SSX-2 37-58和SSX-2 19-34分别是CD4^ T细胞识别相关的HLA-DR及HLA-DP限制表位。日本学也发现SYT-SSX基因融合蛋白断裂点衍生肽是MHC Ⅰ分子HLA-A24和HLA-B7限制的CTL识别的表位。所有这些研究，证明SSX基因家族编码蛋白是肿瘤免疫治疗有前景的靶标之一。     

SSX基因家族HLA-A2.1限制性CTL表位预测及其MHC-Ⅰ亲和力分析

目的通过对肿瘤基因SSX家族不同成员进行CTL表位预测,并对其与MHC-Ⅰ亲和力进行分析,为探索基于SSX肿瘤基因家族的免疫治疗奠定基础。方法利用基于超基序结合量化基序方案开发的HLA-A2.1限制性CTL表位预测软件,对SSX基因家族不同成员进行CTL表位预测,然后合成SSX相关待测表位肽P1(AMTKLGFKA)、P4(AMT-KLGFNV)、P5(AMTKLGFKV)和P6(VMTKLGFKV),再对这些合成肽与MHC-Ⅰ结合亲和力及其结合物稳定性进行实验分析。结果与实验阳性肽(HBcAg,18~27)相比,除P1外,P4、P5、P6均显示较高的结合亲和力;而结合稳定性实验(DC50)结果显示,P1、P4与阳性对照肽(HBcAg,18~27)DC50均大于8 h,而P5和P6的DC50介于2~4 h之间。结论计算机软件预测的CTL表位肽,经过体外亲和力与结合稳定性实验筛选到2条理想的表位肽,为该表位的下一步体内鉴定奠定基础。     

中和性马抗体对SARS-CoV感染的防治作用

目的探讨马抗SARSCoV中和性抗体是否对SARSCoV感染有防治作用。方法用SARSCoV(BJ01株)免疫马匹,从免疫马血清中制备IgGs及其F(ab’)2片段。通过细胞病变法(CPE)、MTT法和空斑形成实验(PFU)等方法,在体外培养的VeroE6细胞中检测F(ab’)2片段对SARSCoV感染的预防性和治疗性作用。再在Balb/c小鼠体内模型中,用CPE法和定量RTPCR方法检测该抗体的保护性效应。结果CPE、MTT和PFU三种方法证实来自三匹马的血清F(ab’)2的中和滴度均达到1∶1600以上。体内实验证实,50μg的F(ab’)2片段可以完全中和1×104TCID50SARSCoV。结论马抗SARSCoV抗体在体内外均能有效地中和SARSCoV和预防其感染宿主细胞,为马抗体将来在大的灵长类动物或人体内进行实验提供实验依据。     

SARS-CoV S1蛋白在甲醇营养型酵母中表达及鉴定

目的获得保持生物学活性、易于纯化、高产量的严重急性呼吸道综合征冠状病毒(severe acute respiratory syndrom coronavirus,SARS-CoV)S1蛋白,以便进一步研究S1蛋白及其抗体的功能.方法将SARS-CoV S1基因重组入酵母表达载体pMETαA,经过酶切和测序鉴定后,通过电穿孔法将重组质粒S1-pMETαA转化入宿主酵母菌株PMAD11,使其在甲醇的诱导下表达目的蛋白.最后用覆盖分析法对重组转化子初步分析,SDS-PAGE和Wesntern blotting法鉴定目的蛋白的表达和特异性.结果酶切鉴定和测序结果证实了S1基因成功地克隆到pMETαA载体中;覆盖分析、SDS-PAGE和免疫印迹法证实S1基因得到正确的表达.结论利用酵母表达系统,成功地克隆和表达了SARS-CoV S1蛋白,为进一步纯化该蛋白和研究其功能奠定了基础.