CD自杀基因系统对T淋巴细胞作用的实验研究

异基因骨髓移植是治愈白血病及某些实体肿瘤的有效手段,但其并发症——移植物抗宿主病(GVHD)目前仍具有相当高的发病率和死亡率,是影响移植成功的主要障碍.在移植前体外去除供者骨髓中的T淋巴细胞可有效减轻GVHD)的发生,但T细胞的去除可使移植物失去移植物抗白     

旋冲钻井在ZG5-H2井的应用

塔中西部非目的层石炭系、志留系等古老地层可钻性差, 机械钻速低, 钻井周期长, 严重影响油气勘探速度, 提高深部地层钻井速度已成为该地区亟待解决的问题。旋冲钻井是钻头在冲击动载和静压旋转的联合作用下高效破岩原理,提高钻速。旋冲钻具在ZG5-H2井志留系机械钻速是中古501井的两倍,同时钻穿志留系用了一个钻头,中古501井用了两个钻头,节省一趟起下钻时间。     

用于基因治疗的慢病毒载体

用于基因治疗的慢病毒载体伍志坚黄海金梁国栋作者单位：１０００５２北京中国预防医学科学院病毒学研究所１９９７年３月４日收稿４月１０日修回基因治疗有望成为治疗遗传病、肿瘤、病毒感染及其它难治性疾病的有效手段，但目前基因转移方法的局限性成为实现这一希望的最...     

Lipofectin介导tk基因转移使B16细胞获得对GCV的敏感性

用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ将真核表达质粒ｐＣＭＶ－ＨｙｇｒｏＴＫ导入小鼠黑色素瘤细胞系Ｂ１６，用潮霉素Ｂ筛选出阳性克隆。聚合酶链式反应检测ｔｋ基因的存在，并在倒置显微镜下动态观察了核苷类似物丙氧乌苷（ＧＣＶ）对ｔｋ￣－和ｔｋ￣＋的Ｂ１６细胞的作用。结果表明，ｔｋ￣＋的Ｂ１６细胞获得了对ＧＣＶ的敏感性，ｔｋ基因／ＧＣＶ使细胞死亡具有“旁观者效应”。     

逆转录病毒载体转移HyTK基因联合应用Ganciclovir对瘢痕成纤维细胞的体外杀伤作用

逆转录病毒载体转移ＨｙＴＫ基因联合应用Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ对瘢痕成纤维细胞的体外杀伤作用柯正，伍志坚，吴小兵，赵健，韩虹，时安平，彭朝晖１型单纯疤疹病毒胸腺激酶基因（ＨＳＶ－１ＴＫ）和潮霉素磷酸转移酶基因（Ｈｙ）相融合的ＨｙＴＫ基因克隆至逆转录病毒...     

逆转录病毒载体LNSHyTK的构建及与丙氧鸟苷联合杀伤B16细胞的研究

构建了一个能表达ＨｙＴＫ的重组逆转录病毒载体ＬＮＳＨｙＴＫ，经包装细胞ＰＡ３１７包装成假型逆转录病毒，并利用此病毒感染了小鼠黑色素瘤细胞株Ｂ１６．聚合酶链反应结果表明假病毒中不含复制活性病毒、ｔｋ基因已成功地被导入了Ｂ１６细胞。总ＲＮＡ斑点杂交显示转染细胞中有稳定的ｔｋ基因转录产物。细胞毒性实验显示，０．０５μｍｏｌ／Ｌ的丙氧鸟苷即可明显降低转染细胞的存活率，表明逆转录病毒介导的ＨyＴＫ基因转移使Ｂ１６细胞获得了对丙氧鸟苷的敏感性。因此，ＨyＴＫ基因／ＧＣＶ可能成为实体瘤的基因治疗途径。     

重组腺相关病毒载体2型转染骨髓间充质干细胞的体外实验

背景：目前应用于基因治疗的病毒载体中，重组腺相关病毒载体2型载体与腺病毒和反转录病毒载体比较，由于其无致病性，引起学者们的关注。目的：观察体外重组腺相关病毒载体2型转染骨髓间充质干细胞，并用其作为携带基因表达的载体进行急性髓性白血病基因治疗的可能性。设计：开放性实验。单位：南方医科大学南方医院的血液科。材料：实验于2004-02／07在南方医科大学南方医院的血液科实验室完成。本实验所用的骨髓间充质干细胞来自急性髓性白血病6例初发患者和4名健康成年志愿者的第3～5代传代细胞。方法：从初发的急性髓性白血病患者和正常健康志愿者髂后上棘做骨髓穿刺抽取6～10mL肝素抗凝的骨髓，分离培养出间充质干细胞，用包含增强型绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒载体2型感染间充质干细胞，将获取的骨髓间充质干细胞加入含一定感染复数(感染复数：1&;#215;10^2．1&;#215;10^3，1&;#215;10^4，1&;#215;10^5，1&;#215;10^6，1&;#215;10^7)的增强型绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒载体2型病毒载体的不完全培养液，10～14d后在相差荧光显微镜下或用流式细胞仪观测绿色荧光蛋白的表达。在体外培养条件下观察绿色荧光蛋白在经过重组腺相关病毒载体2型转导的骨髓间充质干细胞中的表达。体外观察经增强型绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒载体2型转导并被新霉素筛选后绿色荧光蛋白在被转导的骨髓间充质干细胞中的表达。通过相差荧光显微镜下确证绿色荧光蛋白表达后，在BD流式细胞仪上检测绿色荧光蛋白的表达。主要观察指标：①增强型绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒载体2型对骨髓间充质干细胞的转染率分析。②在转染后的不同时间点用相差荧光显微镜和流式细胞仪观察绿色荧光蛋白的表达情况。结果：①转染率分析：增强型绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒载体2型对来源于健康志愿者和急性髓性白血病患者的骨髓间充质干细胞的转染率均不高，转染率在0．3％～1．4％。转染后10～14d绿色荧光蛋白开始表达，一般感染条件绿色荧光蛋白阳性骨髓间充质干细胞所占比例为(1．030&;#177;0．034)％，重复3轮感染条件下为(1．140&;#177;0．036)％，脂质体协助感染条件下为(1．380&;#177;0．054)％，改变转染条件(包括重复感染，延长感染时间，增加感染复数，脂质体协助转染)亦不能明显增加转染率(P&;gt;0．05)，而增强型绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒载体2型却能高效的转染其包装细胞293细胞。②绿色荧光蛋白在体外长期稳定表达分析：实验观察61d内，绿色荧光蛋白保持低水平长期稳定表达，在转染后的12～33d，绿色荧光蛋白阳性的骨髓间充质干细胞从起始时的1．16％下降到0．5％～0．6％，33～61d一直维持在这一水平；经过新霉素筛选30d后，表达绿色荧光蛋白的骨髓间充质干细胞达到6．6％左右，在体外继续传代培养，在体外观察的100d中，表达绿色荧光蛋白的骨髓间充质干细胞一直维持在6％的水平。结论：重组腺相关病毒载体2型介导的基因转导的优势是安全、无免疫反应，目的基因能够长期稳定表达。重组腺相关病毒载体和骨髓间充质干细胞可用于体外基因治疗，其将来可能成为全身基因治疗的良好载体。     

Study of the "killing" effect of retrovirus-mediated HyTK gene transfer on melanoma cell line

Ithasbecomeanoticeablestrategytokilltu-morcellsselectivelybyintroducingtheHerpessimplexvirustype1(HSV1)thimidinekinase(tk)geneintothesecells,followedbytreatmentwithantiviraldrugsuchasganciclovir(GCV).TheclinicaltrialsapprovedbyNIHRACinvolvingretroviral-mediatedtransferofHSVltkgeneintotumorcel1scombinedwithsystemicadministrationofGCVforthetreatmentofbraintumorsandoth-ermalignanttumorsareongoing[']-InthisstudyarecombinantretroviralvectorLHyTK/Nwascon-structed.ThesupernatantfromPA317cel…     

逆转录病毒载体LNSHyTK的构建及与丙氧鸟苷联合杀伤B16细…

构建了一个能表达ＨｙＴＫ的重组逆转录病毒载体ＬＮＳＨｙＴＫ，经包装细胞ＰＡ３１７包装成假型逆围录病毒，并利用此病毒感染了小鼠黑色素瘤细胞株Ｂ１６，聚合酶链反应结果表明假病毒中不含复制活性病毒，ｔｋ基因已成功地被导入了Ｂ１６细胞，总ＲＮＡ斑点杂交显示转染细胞中扔稳定的ｔｋ基因转录产物。细胞毒性实验显示，０．０５μｍｏｌ／Ｌ的丙氧鸟苷即可明显降低转染细胞的存活率，表明逆转录病毒介导的ＨｙＲＴＫ基因转移     

一组可提供AAV载体复制和包装功能的重组HSV-1

目的 构建一组具有AAV载体复制和包装功能的重组HSV-1，从中选出功能较强者用于重组AAV的生产。方法 采用一套含有HSV-1基因组的粘粒系统构建重组HSV-1。首先将2型腺病毒伴随病毒（AAV-2）rep基因的起始密码子ATG人工定点突变成ACG；然后将自身启动子控制下的AAV-2rep(起始密码子突变或未突变）和cap基因分别插入粘粒上HSV-1的UL2基因或UL44基因，构建成重组粘粒cos6-rmc/△UL2,cos56-rc/△UL44cos56-rmc/△UL44；将重组粘粒上的HSV-1片段分别与HSV-1的其余片段进行同源重组，得到3株重组HSV-1，连同过去报道的一株重组HSV-1一起，分别命名为HSV1-rc/△UL2,HSV1-rmc/△UL2,HSV1-rc/△UL44,HSV1-rmc/△UL44。结果 4株重组HSV-1经PCR鉴定均含有rep基因，分别感染携带绿色荧光蛋白（GFP）基因的AAV载体细胞株后均能产生重组AAV，重组AAV可在BHK-21细胞中表达GFP，HSV1-rc/△UL2和HSV1-rmc/△UL2对AAV载体的包装能力明显强于HSV1-rc/△UL44和HSV1-rmc/△UL44。结论 构建的4株重组HSV-1均具有复制和包装重组AAV的能力，其中HSV1-rc/△UL2和HSV1-rmc/△UL2功能较强，有望用于重组AAV的大规模生产。