截断疗法与常规疗法抑制流感病毒性肺炎小鼠肺组织炎症作用的比较?

目的比较"截断疗法"和"常规疗法"对流感病毒性肺炎小鼠肺组织炎症反应的作用,以研究"截断疗法"优于"常规疗法"的作用机制,及与病毒感染后机体发生的炎症级联反应间的关系。方法 Balb/c小鼠192只,分为正常组、模型组、常规疗法组和截断疗法组,以50μL 30 LD50流感病毒鼠肺适应株FM1病毒液滴鼻感染后1 h灌胃给药。正常组和模型组以蒸馏水灌胃;常规疗法组第1、2、3天以银翘散水煎剂灌胃,第4、5、6、7天以犀角地黄汤水煎剂灌胃;截断疗法组第1~7天以犀角地黄汤合银翘散水煎剂灌胃;每日给药2次,共给药7 d。以上处理的小鼠分别于第2、4、6、8天摘眼球放血处死并取材、检测。观察肺泡灌洗液(BALF)白细胞总数,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测小鼠肺组织匀浆上清中白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-18(IL-18)水平,实时荧光定量PCR(Real-Time-PCR)检测小鼠肺组织中NLRP3 mRNA的表达。结果截断疗法组和常规疗法组BALF中白细胞总数、IL-1β和IL-18,及NLRP3 mRNA与模型组比较均有不同程度下降,但截断疗法组在第2天BALF中白细胞总数、IL-1β和IL-18水平与模型组比较有显著降低(P0.01),而常规疗法组尚未显示出明显的作用;第8天截断疗法组白细胞总数明显低于常规疗法组,有显著性差异(P0.01)。感染后第4天,模型组小鼠肺组织中高表达NLRP3 mRNA,截断疗法组NLRP3 mRNA表达明显减少,常规疗法组与模型组比差异不显著。结论截断疗法在感染早期即可抑制固有免疫应答所诱发的炎症反应,有效阻止了随后的炎症级联反应的发生,截断疾病的传变。其机制可能与抑制NLRP3炎性体的形成、干扰IL-1β和IL-18的成熟和分泌有关。     

稳定敲低NLRP3 基因的小鼠巨噬细胞系的建立与鉴定

目的:建立NLRP3 炎性体缺损的小鼠巨噬细胞模型。方法:构建靶向NLRP3 基因的带GFP 和Neo 标记的shRNA 表达载体,转染小鼠巨噬细胞RAW264.7 后用G418 抗性标记筛选稳定转染的细胞克隆,并利用GFP 标记通过流式细胞仪进一步纯化,得到的细胞命名为RAWNKD。利用定量PCR 检测RAWNKD 细胞及其在LPS 和ATP 联合刺激下NLRP3 基因的稳定抑制效果。结果:RAWNKD 细胞GFP 标记的阳性率在80%以上,NLRP3 基因的抑制率超过90%,即使用LPS 和ATP联合刺激NLRP3 基因mRNA 增加也不明显。结论:成功建立了NLRP3 基因稳定敲低的小鼠巨噬细胞系,这种NLRP3 炎性体缺损的巨噬细胞是探究NLRP3 炎性体活化途径及其介导的炎症信号转导的有力工具。     

犀角地黄汤合银翘散通过PKC-SSeCKS通路抑制TNF-α诱导的肺微血管内皮细胞通透性增加

目的:观察犀角地黄汤合银翘散(XDY)对TNF-α诱导的大鼠肺微血管内皮细胞(PMVEC)通透性的影响及其与PKC-SSeCKS信号通路的关系,以探究该方治疗病毒性肺炎的作用环节和分子机制。方法:原代培养大鼠PMVEC,在Transwell小室上用电导法于不同时点监测TNF-α诱导的PMVEC跨内皮细胞单层电阻(TER)测定其通透性。不同的干预因素作用24 h后,检测PMVEC的TER、PKC活性、SSeCKS mRNA水平和磷酸化SSeCKS蛋白水平,激光共聚焦显微镜观察PMVEC中SSeCKS的定位和F-actin的结构变化。结果:TNF-α作用24 h后PMVEC通透性达高峰;与对照组比较,TNF-α组TER降低,PKC活性增强;与TNF-α组比较,TNF-α加PKC抑制剂组和TNF-α加XDY含药血清组PKC活性降低,而TER升高且与对照组无差别。与对照组比较,TNF-α组SSeCKS的mRNA和蛋白表达升高;与TNF-α组比较,TNF-α加XDY含药血清组SSeCKS的mRNA水平和磷酸化SSeCKS蛋白水平降低。对照组PMVEC中F-actin主要分布在细胞周边和核周,形成致密周围束,SSeCKS均匀散在分布于细胞中;TNF-α组细胞周边的F-actin致密束基本消失,SSeCKS集中分布于核周;TNF-α加含XDY含药血清组F-actin结构及SSeCKS的分布趋于正常。结论:犀角地黄汤合银翘散可以抑制TNF-α诱导的PMVEC PKC信号通路的激活,降低PKC结合底物SSeCKS的表达,最终影响肌动蛋白的变构、阻止内皮细胞变形而降低PMVEC的通透性。