阳离子多聚物PEI结合电穿孔实现小鼠精子的核内转染

目的联合运用阳离子多聚物PEI和方波电穿孔两种不同机制的转染手段,以期克服精子难转染的问题。方法采用FITC标记的线性阳离子多聚物JetPEI-FluoF与适量的质粒pCX-EGFP形成复合物作为转染示踪物质进行转染,通过激光共聚焦显微镜,检测复合物在细胞的分布情况。结果与对照组单纯使用PEI转染相比较,联合使用组虽然精子活力和活率有一定程度的下降,但是无论胞质还是胞核荧光物质的携带量都有很大程度的提高,实现了对精子的核内转染。结论本实验为我们以后开展大动物精子载体法的研究提供了一个成功的模式。     

获得性梗阻性无精症患者预处理改善经皮附睾穿刺-卵胞浆单精子注射治疗结局的临床研究

目的分析获得性梗阻性无精症患者预处理对经皮附睾穿刺-卵胞浆单精子注射（PESA-ICSI）治疗结局的影响。方法选择2009年1月～2011年6月南京军区福州总医院生殖中心诊断为获得性梗阻性无精症（OA）的患者109例,随机分为两组。预处理组55例,临床检查有附属腺炎症或微生物感染患者先给予抗生素和抗炎治疗,接着给予抗氧化和促进附睾精子成熟治疗2个月（十一酸睾丸酮40mg,p0,qd,维生素C200mg,po,bid,维生素E100mg,po,bid,左卡尼汀1．0g,po,bid）,无附属腺炎症或微生物感染患者,直接抗氧化和促进附睾精子成熟治疗;对照组54例,有附属腺炎症指征患者给予抗炎、抗感染治疗,余未作任何处理。比较两组诊断日与ICSI日精子活动力和ICSI后胚胎发育和临床结局。结果①两组诊断日经附睾穿刺液精子的总活动率和前向运动精子率差异均无统计学意义（P〉0．05）。ICSI日预处理组精子总活动率和前向运动精子率均有提高（P〈0．01）,而对照组无明显变化（P〉0．05）;两组ICSI日精子总活动率和前向运动精子率比较,差异有统计学意义（P〈0．05）。②两组受精率、卵裂率差异无统计学意义（P〉0．05）;预处理组优质胚胎率为67．26％,高于对照组的60．49％,差异有统计学意义（P〈0．05）;预处理组临床妊娠率和植入率分别为47．16％和29．72％,高于对照组的37．25％和23．36％,但差异无统计学意义（P〉0．05）。结论对获得性OA患者进行抗氧化、促进精子成熟的预处理治疗,可以提高精子活动力,能够改善胚胎质量,但是对于ICSI治疗后临床妊娠率和植入率的影响还需要更大样本的观察。     

卵巢次优反应人群行拮抗剂方案取消移植的影响因素探讨

目的 探讨影响卵巢次优反应人群行拮抗剂方案体外受精/卵胞质内单精子注射 -胚胎移植(IVF/ICSI-ET)中新鲜周期取消移植的影响因素和对策。方法 采用回顾性病例对照研究,选取2016年7月~2018年6月在中国人民解放军联勤保障部队第900医院生殖医学中心采用拮抗剂灵活方案超促排卵的169例卵巢次优反应患者的临床资料,以黄体期激动剂长方案患者148例为对照组,拮抗剂方案组根据是否新鲜周期移植进一步分为鲜胚移植亚组(119例)、高孕酮取消移植亚组(32例),比较组间的临床和实验室情况。结果 拮抗剂方案与长方案应用于卵巢次优反应人群,均可获得较好的新鲜周期移植的临床妊娠率以及累积活产率,差异无统计学意义(P>0.05);拮抗剂方案组新鲜周期移植取消率29.58%,高于长方案组的10.81%,差异有统计学意义(P<0.05)。早发孕酮升高(扳机日血清孕酮≥1.5ng/ml)是拮抗剂方案组取消鲜胚移植的最主要原因。拮抗剂方案两亚组比较,经黄体期雌激素预处理,高孕酮取消移植亚组较鲜胚移植亚组超促排卵启动日血清雌二醇更低、促黄体生成素较高,更早加拮抗剂,差异有统计学意义(P<0.05);两亚组外源性促性腺激素总量和总使用天数,扳机日促黄体生成素、获卵数、优胚数等比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 卵巢次优反应人群行拮抗剂方案可以获得与激动剂黄体期长方案相当的累积活产率;早发孕酮升高是拮抗剂方案取消鲜胚移植的最主要原因;可能的危险因素包括雌激素预处理反应不良、过早添加拮抗剂、拮抗剂使用剂量过大或时间过长等。     

孕8～12周终止妊娠后服用屈螺酮炔雌醇避孕效果观察

目的:观察孕8～12周妊娠终止后服用屈螺酮炔雌醇避孕药(商品名:优思明)的疗效。方法:将90例终止妊娠患者分为观察组(60例)和对照组(30例),观察组自胚胎排出清宫术或钳刮术后当晚开始每日睡前服用优思明1片,21天后停药;对照组术后未服用该药,两组患者均于术后14天及月经来潮干净后随访2次,观察术后阴道流血时间、流血量及流产后初次月经恢复情况;观察优思明服用期间的不良反应及患者接受程度等。结果:观察组术后阴道出血时间(6.20±4.40)天,对照组(10.30±6.40)天,两组比较差异有统计学意义(P<0.001);将以往月经量视为1,观察组出血量为(0.48±0.27),对照组为(0.97±0.42),两组比较差异有统计学意义(P<0.001);术后初次月经恢复情况:观察组月经恢复时间可预测,停优思明3～4天后行经,平均(24.50±3.50)天,行经时间(4.70±1.60)天,经量(0.57±0.30);对照组停优思明后平均(33.50±4.50)天行经,行经时间(5.70±1.30)天,经量(1.03±0.32),两组比较差异有统计学意义(P<0.005);服用优思明期间出现不良反应4例,占5.71%,愿意继续使用优思明避孕占14.33%,不愿意者占85.67%。结论:妊娠终止后及时服用优思明可以减少阴道出血量,缩短出血时间,促进月经恢复,可靠避孕,避免重复流产,月经量多者可减少月经量,缓解痛经,不良反应少,但大多数观察者对继续服用激素类药仍不能接受。     

人组织型纤溶酶原激活剂牛乳腺生物反应器的研究

目的 构建组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)乳腺定位表达载体，使其在牛乳汁中高效表达，从而建立牛乳腺生物反应器。方法 RT-TD-PCR法克隆目的基因，通过酶切、连接、分离、纯化等方法构建含t-PA-cDAN的乳腺定位表达载体：采用显微注射法和乳腺注射法将融合基因转入小鼠的受精卵和小鼠及牛的乳腺组织中。结果 显微注射法和乳腺注射法转基因后，t-PA可在小鼠和牛的乳汁中表达。结论 所构建的乳腺定位表达载体可有效地使t-PA基因在小鼠和牛乳汁中表达，t-PA基因的表达不受转基因方法的影响，但t-PA在牛乳汁中的表达量明显高于小鼠的表达量。提示不同动物的乳蛋白调控系统有一定的差异，可能受着不同的因素或调控系统的影响。     

控制性超促排卵时未添加拮抗剂患者的临床结局分析

目的分析探讨促性腺激素释放激素(Gn RH)拮抗剂方案中不需要添加拮抗剂患者的相关因素及其促排卵结局。方法回顾性队列研究本院生殖医学中心2015年3月—2016年9月期间行GnRH拮抗剂方案超促排卵中未添加拮抗剂的141例患者(A组)及添加拮抗剂的282例患者(B组)的治疗过程中的激素变化及促排卵结局。结果刺激周期中雌二醇(E_2)以及孕酮(P)水平差异均无统计学意义。A组患者促性腺激素(Gn)第6日黄体生成素(LH)水平[(1.97±1.81)IU/L]显著低于B组患者[(4.08±5.37)IU/L,P0.001),A组Gn第6日直径11 mm的卵泡数(14.7±10.4)显著高于B组(12.0±8.9,P=0.004);A组Gn第8日LH水平[(2.48±1.61)IU/L]显著低于B组患者[(4.04±3.45)IU/L,P0.001],Gn第8日A组直径11 mm的卵泡数(7.1±8.9)也显著高于B组(4.9±6.3,P=0.008)。获卵数、成熟卵子数、双原核(2PN)受精数、优质胚胎数以及形成优质囊胚数差异均无统计学意义(P0.05)。结论在拮抗剂方案超促排卵过程中,部分患者即使不添加拮抗剂也不会出现LH峰或提前排卵,且这部分患者与常规添加拮抗剂患者相比能获得相似的促排卵结局。     

氨基酸浓度对昆明小鼠胚胎体外发育的影响

目的探讨培养液中氨基酸成分对植入前昆明小白鼠胚胎发育的影响,摸索植入前胚胎体外培养氨基酸的最佳浓度.方法从超排昆明小鼠输卵管中取出的630枚受精卵均分为7组,分别在经添加不同浓度Eagle‘s氨基酸的去牛血清白蛋白KSOM培养液(mKSOM、mKSOM 1/16AA、mKSOM 1/8AA、mKSOM 1/4AA、mKSOM 1/2AA、mKSOM AA、mKSOM 2AA)中培养,对比观察各组胚胎体外发育的过程.用卡方检验分析添加各浓度氨基酸的培养液培养效率的差别,并将8细胞发育率和囊胚发育率分别与相应的氨基酸浓度进行曲线拟合分析.结果与未添加氨基酸组对比,添加氨基酸组胚胎发育率高,8细胞胚和囊胚的形成率与培养液中氨基酸的浓度关系均符合三次模型,在氨基酸为 1/2浓度时8细胞胚和囊胚的形成率均达到最高.结论氨基酸对胚胎的体外发育有促进作用,但含有高浓度氨基酸的培养液培养效果反而有所下降,可能是由于高浓度的氨基酸影响胚胎的代谢和渗透压的改变,且氨基酸分解及胚胎代谢所产生的铵对胚胎有毒性作用.     

KSOM培养基营养成分调整对小鼠植入前期胚体外发育的影响

目的 囊胚发育率低和发育迟缓是继“2-细胞阻滞”解决后小鼠胚胎体外培养中面临的两大问题。本实验通过对KSOM培养基营养成分的调整,观察对胚胎发育的影响,优化培养基的构成。方法 采用微滴培养法培养昆明小鼠单细胞胚胎,以胚胎发育到囊胚的比例、孵出比例以及注射hCG后120h囊胚全细胞数作为判断培养效果的标准,比较KSOM在葡萄糖、牛血清白蛋白、氨基酸3种营养物质不同浓度下对小鼠植入前胚体外培养的效果。结果 在未加氨基酸时葡萄糖、牛血清白蛋白的变化对注射hCG后120h囊胚形成率、囊胚全细胞数影响不大,添加氨基酸后,囊胚发育速度提高,部分孵出和全部孵出比例提高,囊胚全细胞数增大明显,且葡萄糖、牛血清白蛋白与氨基酸对囊胚的发育有共同促进的作用。结论 通过添加适量的氨基酸、葡萄糖、BSA改良KSOM培养基能很好的促进小鼠植入前胚体外发育。     

氨基酸浓度对昆明小鼠胚胎体外发育的影响

目的探讨培养液中氨基酸成分对植入前昆明小白鼠胚胎发育的影响,摸索植入前胚胎体外培养氨基酸的最佳浓度。方法从超排昆明小鼠输卵管中取出的630枚受精卵均分为7组,分别在经添加不同浓度Eagle's氨基酸的去牛血清白蛋白KSOM培养液(mKSOM、mKSOM 1/16AA、mKSOM 1/8AA、mKSOM 1/4AA、mKSOM 1/2AA、mKSOM AA、mKSOM 2AA)中培养,对比观察各组胚胎体外发育的过程。用卡方检验分析添加各浓度氨基酸的培养液培养效率的差别,并将8细胞发育率和囊胚发育率分别与相应的氨基酸浓度进行曲线拟合分析。结果与未添加氨基酸组对比,添加氨基酸组胚胎发育率高,8细胞胚和囊胚的形成率与培养液中氨基酸的浓度关系均符合三次模型,在氨基酸为1/2浓度时8细胞胚和囊胚的形成率均达到最高。结论氨基酸对胚胎的体外发育有促进作用,但含有高浓度氨基酸的培养液培养效果反而有所下降,可能是由于高浓度的氨基酸影响胚胎的代谢和渗透压的改变,且氨基酸分解及胚胎代谢所产生的铵对胚胎有毒性作用。     

零原核胚胎利用价值的探讨

目的比较未见原核(0PN)与正常原核(2PN)来源优质囊胚的妊娠结局,探讨0PN胚胎的利用价值。方法收集2013年1月至2014年12月在本中心行助孕治疗、鲜胚移植失败或取消移植后行冻融优质囊胚移植的784例患者为研究对象,以移植0PN来源冻融优质囊胚的患者为0PN组,移植2PN来源冻融优质囊胚的患者为2PN组,分析0PN、2PN卵裂胚的优质囊胚形成率,并比较两组患者的胚胎种植率、临床妊娠率和流产率等。结果 0PN卵裂胚的总优质囊胚形成率显著低于2PN卵裂胚(37.17%vs.44.49%),但第3天卵裂球8细胞以上胚胎优质囊胚形成率0PN胚胎显著高于2PN胚胎(67.45%vs.57.16%)(P均0.01)。囊胚移植后0PN组的种植率(71.15%vs.53.74%)、临床妊娠率(80.00%vs.64.32%)、抱婴率(68.00%vs.55.71%)显著高于2PN组(P均0.05);两组出生婴儿体重、身长、Apgar评分、畸形率等比较无显著性差异(P0.05)。结论 0PN来源优质囊胚的利用价值值得关注。0PN胚胎可能只是在设定的观察时间内未观察到原核,而并不一定是异常受精。对于无可利用优质胚胎的患者,临床上可以将0PN胚胎继续培养至囊胚,然后进行移植,以提高患者的胚胎利用率和临床妊娠率。但因为0PN胚胎存在染色体异常的可能性仍较大,建议能结合遗传学筛查技术,以获得更确切的信息,指导临床应用。