外周血捕获循环肿瘤细胞的有效方法研究

目的建立有效获取肿瘤患者外周血中单个循环肿瘤细胞（CTC）的方法。方法预先将经DiI染色的SW480 细胞混入健康成人的抗凝全血中,分别单独采用密度梯度离心（OncoQuick）、淋巴细胞分离术（Ficoll）、“玫瑰花富集”（RosetteSep）、免疫磁珠（CELLection）及淋巴细胞分离术联合免疫磁珠联用（Ficoll+CELLection）富集这些肿瘤细胞,统计回收率并观察纯度以进行比较。再使用显微操作仪捕获单个NCI-H460、HCT-116、DLD-1、SW480、TF-1 等探测细胞及从肝癌患者外周血中富集获得的CTC,采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）技术分析单细胞的CD45 mRNA 表达水平。结果5 组方法的肿瘤细胞回收率分别为（52.5±3.5）%、（46.6±1.9）%、（36.9±5.5）%、（14.1±3.1）%和（8.8±1.4）%;单因素方差分析表明,5 组方法回收率比较差异有统计学意义（p <0.05）;SNK-q 检验表明,除OncoQuick 组和Ficoll 组（p >0.05）、CELLection组和Ficoll+CELLection 组（ p>0.05）外,其他各组之间的差异均有统计学意义（p <0.05）。在荧光显微镜下观察富集的肿瘤细胞,发现CELLection 组及Ficoll+CELLection组的纯度更高。qRT-PCR结果显示,总循环数60,GAPDH Ct 均值为（29.94±0.59）,除了单个TF-1 细胞的CD45 Ct 均值为（34.21±0.22）,其他单个探测细胞及CTC 的CD45 均无表达。结论CELLection 即免疫磁珠法配合显微操作能有效获取肝癌患者外周血中的单个CTC 并保留其原始的分子特性,适用于后续单细胞分析与研究。该方法为CTC 运用于剖析肿瘤分子的特征、评价靶向治疗药物的药效以及监控肿瘤的复发与转移等临床问题奠定了基础。     

siRNA干扰Id1表达对卵巢癌化疗耐药性的影响

目的:利用siRNA技术降低细胞分化抑制因子(Id1)在卵巢癌细胞SKOV3、HO-8910中蛋白水平的表达,并探讨其对化疗耐药性的影响.方法:利用Id1-siRNA干扰Id1 RNA水平的表达,采用蛋白印迹实验检测卵巢癌细胞SKOV3、HO-8910中Id1蛋白水平的表达;转染siRNA后,实验细胞的培养液中加入顺铂,部分复孔在加入顺铂的同时各自加入细胞化学通路抑制剂BHA、Sp600125、Necrostain、z-VAD-fmk,培养48小时后分别利用MTT、LDH检测细胞的生存率、死亡率.结果:①卵巢癌细胞株SKOV3、HO-8910中均有Id1蛋白水平的表达.②Id1 -siRNA组中Id1蛋白水平的表达比空白对照组、阴性对照组中的表达明显降低.③Id1 -siRNA组细胞死亡率明显低于空白对照组、阴性对照组.④z-VAD-fmk组细胞死亡率明显低于顺铂组,其余各组无明显变化.结论:Id1 -siRNA干扰Id1 RNA水平的表达,降低Id1蛋白水平的表达,通过调节下游的凋亡通路,能有效降低卵巢癌细胞株对顺铂的耐药性.     

一种椎间盘组织总RNA提取的改良方法

目的改进传统常规法在椎间盘组织中总RNA提取,获得高质量的椎间盘组织总RNA。方法健康成年Newsland白兔,完整取出椎间盘组织,随机分RNA传统方法组和酶消化改良组。传统组,按Trizol法提取总RNA;酶消化改良组,加入0.2%Ⅱ型胶原酶,置于细胞培养箱消化数小时,加入含小牛血清的PBS液终止,离心收集细胞。余步骤同传统组。结果传统组,电泳结果未见28S和18S条带,5S条带部分可见;A260/280比值在1.5左右,蛋白多糖污染重。而酶消化组,电泳结果可见清晰的28S、18S和5S条带,且28S条带的亮度约是18S的两倍;A260/280比值在1.8～2.0之间,无蛋白污染,此法提取的RNA,逆转录后可用于扩增β-actin基因。结论酶消化改良法可望成为椎间盘组织总RNA提取的好方法。RNA片断完整,纯度高,无蛋白污染,不影响后续基因表达（RT-PCR）的分析,并且重复性好,可以推广。     

热休克蛋白90抑制剂对TNFα诱导肿瘤细胞凋亡和调控NF-κB信号通路的影响

目的探讨热休克蛋白90(heat shock protein 90,HSP90)抑制剂17-di methylamino-ethylaminogeldanamycin(17DMAG)对肿瘤坏死因子α(TNFα)诱导的肿瘤细胞凋亡的影响及其作用机理。方法采用乳酸脱氢酶释放实验检测不同剂量的17DMAG与TNFα共培养对子宫颈癌细胞株HeLa和卵巢癌细胞株SKOV3的细胞毒作用,吖啶橙/溴化乙锭双重染色后荧光显微镜下观察17DMAG和TNFα共同处理所导致的细胞形态学改变,并采用Western blot检测细胞凋亡相关分子半胱天冬酶-8(caspase-8)、半胱天冬酶-3(caspase-3)、多聚(ADP-核糖)聚合酶〔poly(ADP-ribose)polymerase,PARP〕和TNFα诱导的核因子-κB(NF-κB)信号通路信号分子receptor-interaction protein(RIP)、IκB kinaseβ(IKKβ)、inhibitor of IκB(IκBα)的变化。结果 17DMAG可增强TNFα对HeLa细胞和SKOV3细胞的杀伤作用,17DMAG可抑制TNFα诱导的NF-κB信...