我国人类朊病毒病检测监测体系建立及相关基础和应用研究

目的在我国开展克雅氏病(CJD)监测,探讨朊病毒病的发病机制。方法采用多学科交叉技术开展以疾病监测为导向的应用研究和发病机制为导向的基础研究。结果建立了CJD病原学诊断技术,制定了《克雅氏病诊断标准》,开展了覆盖12个省(市)自治区的CJD监测。首次较全面地了解了我国CJD病人的流行病学、临床和实验室特征;首次报道了我国多种遗传型CJD病例。建立了包括朊病毒实验动物平台、体外无细胞转化平台、PMCA平台、PrPSc抗原库等技术平台。首次发现了朊病毒可利用脾脏和肌肉组织进行复制、NADPH可促进PrPSc增殖;系统描述了PrPSc和其他神经因子在疾病潜伏期和终末期的变化;报道了PrP蛋白与多种神经蛋白发生相互作用;证明了PrP蛋白序列、二级结构、糖基化类型及胞内存在位置的改变均可诱导细胞凋亡。结论本研究直接服务于我国朊病毒病的防控工作,为朊病毒的研究积累了重要的科学数据。     

脾囊肿1例

患者，女，38岁，主因“体检发现脾占位1个月”入院。1个月前患者在巨鹿县医院体检中心胸透时发现左膈下圆环状致密影，并行腹部彩超及CT等检查。腹部彩超：脾脏占位。胸片：支气管炎。上腹部CT：腹膜后囊肿。强化CT：脾门区可见类圆形较低密度影，较大经线9．5cm×8．6cm，壁厚，伴钙化，其内密度均匀，CT值约23Hu，相临脾脏受压。查体胸廓呈桶状胸，     

PrP及其缺失突变体与GFAP体外相互作用的初步研究

目的研究PrP蛋白与GFAP蛋白是否发生分子间相互作用以及PrP蛋白多肽链中与GFAP蛋白相互作用的区域。方法制备仓鼠脑组织匀浆上清,通过原核表达系统以及体外翻译系统表达了全长的小鼠GFAP蛋白、人PrP蛋白以及各种缺失突变体,利用Pull-down及免疫共沉淀实验检测PrP与GFAP的分子间相互作用。结果不仅重组的GFAP与PrP发生分子间的相互作用,而且脑组织中的GFAP与PrPC及PrPSc也发生相互作用。PrP与GFAP蛋白相互作用的区域位于PrP的C端第91至231位氨基酸。结论PrP及其缺失突变体与GFAP在体外能够发生分子间的相互作用,提示GFAP可能参与朊蛋白的正常生理功能或者朊病毒病的病理过程。     

通用型病毒检测芯片在三种人类致病病毒属检测中的应用

目的 研究制备对人类有致病作用的38个属的病毒寡核苷酸（oligo）基因芯片对三种人类致病病毒的检测能力。方法 应用生物信息学软件设计70-mer oligo探针，固定于玻片载体制备成基因芯片。以痘苗病毒天坛株、甲肝病毒、乙肝病毒作为检测样本，提取病毒核酸，经随机引物扩增、荧光标记，用于芯片杂交，清洗和干燥后对芯片进行扫描和数据分析。结果 芯片上oligo探针能与相应病毒的PCR扩增样品杂交，呈现阳性荧光信号。结论 建立的病毒寡核苷酸基因芯片能够检出和区分三种检测病毒，为进行未知病毒的基因芯片筛查方法的建立奠定了基础。     

COL1A2新突变致胎儿严重成骨不全症1例报告

目的 总结1例COL1A2新突变致胎儿严重成骨不全症（OI）的临床特征及基因突变的特点,为胎儿产前咨询提供依据。方法 对产检B超检查示OI可能的胎儿流产组织抽提DNA进行基因型分析,自行设计COL1A1和COL1A2所有外显子及剪接区域的引物。利用Sanger测序法对胎儿行COL1A1和COL1A2 基因外显子及剪接区域的测序分析并行父母验证。依据人类基因突变数据库（HGMD）专业版,对COL1A2突变所致疾病临床表型行文献复习。结果 胎儿的COL1A1和COL1A2基因均检测出变异位点。COL1A2基因检测到杂合突变（c.3142G>T, p. Glu1048Cys）在寡核苷酸多态性数据库、HGMD及Ⅰ型胶原蛋白突变数据库均未见报道,结合胎儿父母验证为新发突变,对比公共数据库及在线预测软件预测该突变类型为致病突变。在HGMD专业版中搜索COL1A2,共检索到387个COL1A2致病突变,与21种疾病及其亚型相关。92%的突变引起OI或其亚型,还可引起Ehlers-Danlos综合征或其亚型。结合COL1A2突变所致疾病临床表型行文献复习,本文报告胎儿符合Ⅱ型OI。结论 产前通过超声影像结合基因分型诊断胎儿为COL1A2基因新发突变（c.3142G>T, p. Glu1048Cys）所致Ⅱ型OI; COL1A2基因编码蛋白长链双螺旋的400～480氨基酸及MLBR 3区域中甘氨酸被天冬氨酸或谷氨酸替代,多导致严重表型的OI;本文为产前准确预测胎儿结局、指导临床决策提供依据。     

基于单中心儿童样本库人群全外显子组数据的致病突变携带者分析

目的 通过对比公共数据库和复旦大学附属儿科医院分子诊断中心（复旦儿科）样本库全外显子组测序（WES）数据中已知儿童致病突变频率差异,推测中国人群隐性遗传致病基因携带者频率分布。方法 整理公共数据库（OMIM、ClinVar、HGMD）中常染色体隐性遗传病的致病基因和突变位点,计算复旦儿科样本库中的WES数据,基于公共数据库的致病基因的携带者频率。结果 从公共数据库分析中共得到1 368个常染色体隐性致病基因上的60 209个位点。在复旦儿科1 147例临床WES样本中,共筛出408个基因上的1 016个突变位点。比较复旦儿科、人类外显子组整合数据库（ExAC）东亚（4 312例）和欧洲人群（33 301例）突变位点的出现频率,3个人群中均发现了人群特有的突变位点,相比ExAC欧洲人群,复旦儿科人群中的突变位点出现频率与ExAC东亚人群更为相近。在携带者频率>1%的基因中,复旦儿科和ExAC东亚人群相同的基因分别为70/81个（86.4%）和70/102个（68.6%）;复旦儿科和ExAC欧洲人群相同的基因分别为37/81个（45.7%）和37/136个（27.2%）。结论 通过与ExAC东亚和欧洲人群数据进行对比,中国人群中隐性致病基因及致病突变位点的携带者频率与ExAC东亚人群较为相似,与欧洲人群差异较大,建立针对中国人群特异性的常见遗传携带者突变位点筛查项目十分必要。     

鼠源抗haPrP23-231噬菌体抗体库的构建和初步鉴定

目的构建和鉴定鼠源抗haPrP23-231噬菌体抗体库。方法利用纯化的朊蛋白抗原免疫BALB/c小鼠,取脾,提取细胞总RNA,逆转录cDNA,以其为模板进行免疫球蛋白Fab区基因的特异性PCR扩增,将轻链和重链Fd段基因分别构建到pComb3质粒,构建噬菌体抗体库。结果经过四轮"吸附-洗脱-富集"的过程后获得了12株阳性克隆。挑取5株进行序列分析,并将结果与GenBank中已知序列库中的IgG序列进行比较,得到了两株不同的抗体,并进行了初步鉴定。结论本研究为朊病毒病的研究奠定了基础。     

PrP八肽重复突变体对细胞生长影响的探讨

目的探讨PrP八肽重复突变体对细胞生长的影响。方法将具有遗传性朊病毒病相关不同八肽重复区插入突变的PRNP基因表达载体瞬时转染HeLa细胞,经噻唑蓝比色法(MTT)、Annexin-V/PI双染流式细胞检测。结果多八肽突变PrP蛋白对细胞的毒性作用较野生型明显增强。多八肽突变PrP较野生型更容易诱导凋亡发生,多八肽突变组早、晚期凋亡率均高于野生组。结论遗传性朊病毒病相关多八肽突变PrP蛋白可能较野生型更易诱导细胞凋亡发生。     

椎体软骨发育不良伴免疫调节异常1 例基因诊断及文献复习

目的探讨1例罕见的矮小症伴多系统异常病例的临床和实验室诊断。方法采用全外显子组测序技术,结合高通量数据分析流程进行基因检测,并采用Sanger测序进行验证。结果患儿,男,14岁,发现身材矮小5年余。身高132cm,有面部色素沉着斑点和甲癣。外翻足已手术矫正,因自身免疫性溶血性贫血长期口服泼尼松治疗。头颅CT示两侧基底节、两侧额叶及左侧顶叶多发性钙化。脊柱平片示胸腰椎椎体变扁。全外显子组测序结合Sanger测序验证,发现ACP5基因纯合致病突变(c.643GA,p.G215R),确诊为罕见的椎体软骨发育不良伴免疫调节异常(SPENCDI)。结论全外显子组测序是确诊疑难罕见病的有效方法之一。     

纳米材料对细胞IGF-Ⅰ mRNA表达水平的影响

①目的探讨纳米材料对胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ) mRNA表达的影响.②方法通过原位杂交、斑点杂交及定量分析技术分别检测银系纳米材料组、稀土纳米材料组与对照组WI-38及Hela细胞IGF-Ⅰ mRNA表达.③结果银系纳米材料组、稀土纳米材料组与对照组的细胞均有IGF-Ⅰ mRNA杂交阳性信号表达.膜上斑点杂交经吸光度扫描表明,WI-38细胞及Hela细胞银系纳米材料组吸光度值与对照组相比差异均无显著性(F=12.4～31.2,tD=1.2～1.8,P>0.05);而稀土纳米材料组吸光度值较对照组均显著性降低(tD=3.2～4.6,P<0.01).④结论银系纳米材料对IGF-Ⅰ mRNA的表达无影响;而稀土纳米材料对IGF-Ⅰ mRNA的表达有较强的抑制作用,在一定程度上影响了其在医学上的应用.