骨髓间充质干细胞移植治疗肺动脉高压大鼠肺血管病变的研究

目的探讨骨髓来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)移植对野百合碱诱导的实验性肺动脉高压大鼠肺血管病变的干预作用。方法体外分离、培养并纯化SD大鼠骨髓MSCs。健康雄性SD大鼠随机分为3组,肺动脉高压组(n=20)、MSCs移植组(n=20):2组大鼠均一次性向背部皮下注射野百合碱50 mg/kg,诱导肺动脉高压动物模型;正常对照组(n=15):注射同体积的生理盐水。同等条件饲养3周后,MSCs移植组大鼠经舌下静脉注射5×106/ml的经Hoechst33342荧光染料标记的MSCs细胞悬液1 ml,肺动脉高压组和正常对照组大鼠注射等量L-DMEM液。移植后观察4周,测定3组大鼠生存率、肺动脉平均压、肺小动脉的微观结构的改变。结果肺动脉高压大鼠移植MSCs 4周后,生存率由30%上升到90%,肺动脉平均压由(42.7±2.3)mmHg下降到(24.7±2.3)mmHg,下降了50%;右心指数由(45.30±3.13)%下降到(37.90±3.18)%(q=29.86,P<0.01),肺小动脉病变得到有效改善。荧光显微镜观察到Hoechst 33342标记的MSCs在肺内定植且分化成大量新生血管并形成侧枝循环,肺动脉重构得到有效逆转。结论MSCs移植可有效减轻并逆转肺动脉重构的进程,其作用机制是MSCs分化形成新生血管,建立了侧枝循环,从而修复野百合碱诱导的肺血管损伤。     

人成纤维细胞饲养层的制备及其对胚胎干细胞生长支持作用

 目的 为建立不含动物细胞成分的人胚胎干细胞( human embryonic stem cell, hESc)体外培养系统，本实验欲用人包皮成纤维细胞(human postnatal foreskin fibroblasts, hPFF)制备细胞饲养层并观察其对hESc体外生长的支持功能及生物学特性的维持作用。方法 利用儿童阴茎包皮环切术后遗弃包皮组织分离培养成纤维细胞，纯化增殖细胞，采用35Gyγ射线照射灭活法制备成饲养层。将hESc（HS181细胞株）接种在该饲养层上，连续传代至20代，倒置显微镜观察其形态学变化，测定其细胞碱性磷酸酶活性，类胚体形成实验及干细胞转录因子表达，严重联合免疫缺陷的小鼠(severe combined immune deficiency mice, SCID)体内畸胎瘤形成及体内全能分化特性实验对hESc生物学特性进行鉴定。 结果 hPFF体外培养过程中生长增殖旺盛，连续传20代以上能保持正常细胞形态学和生物学特性。经γ射线照射使其停止增殖，24h内能较好地保持细胞活力和形态学特征，具备饲养层细胞基本条件。HS181 hESc在hPFF上传到20代任能较好地保持未分化状态，细胞呈克隆性生长，高度表达碱性磷酸酶及Oct-4、Nanog等胚胎干细胞转录因子；悬浮法培养连续传20代的hESc可获得由3个胚层细胞所形成的类胚体（Embryoid bodies, EB）结构, 可检测到CD90、Flt-1、Nestin基因的表达，证明得到的类胚体中含了3个胚层细胞，说明hESc具有体外多能干性特征。体内全能分化实验显示：将第20代的hESc接种到SCID小鼠体内,6周后可形成畸胎瘤,组织学切片分析其包含了源于全部3个胚层的各种分化细胞,直接证明其具有体内多向分化的全能性。结论 hPFF可作为一种来源丰富，取材方便的人源化饲养层细胞，能有效地支持hESc体外生长。克服了目前hESc建系和体外培养过程中使用动物细胞饲养层带来的异种蛋白污染和致病微生物的危险，初步解决了hESc临床应用的生物安全性问题。     

非手术性癌痛患儿自控镇痛方式及比较研究

目的探究两种镇痛方式治疗儿童非手术性癌痛的效果及安全性。方法对36例非手术性癌痛患儿疼痛发生情况及程度进行评估,对疼痛原因及应用自控镇痛(PCA)或照顾者代理镇痛(AACA)效果进行分析。结果 36例中52.78%的疼痛原因为口腔炎,22.22%为局部感染;初始疼痛、复评疼痛、镇痛期间疼痛程度差异有统计学意义(P<0.01);PCA/AACA相关不良反应包括便秘及神经系统不良反应,PCA与AACA镇痛效果及不良反应比较,差异无统计学意义(均P>0.05)。结论非手术性癌痛患儿中到重度疼痛的主要原因是口腔炎和局部感染。PCA/AACA可安全且有效地用于非手术性中重度癌痛控制。     

同源异体骨髓间充质干细胞移植对大鼠实验性肺动脉高压的治疗作用

目的探讨同源异体骨髓来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)移植对大鼠实验性肺动脉高压的治疗效果及作用机制。方法体外分离、培养并纯化SD大鼠骨髓MSCs。健康雄性SD大鼠随机分为3组,正常对照组(n=15)、肺动脉高压组(n=30)、MSCs移植组(n=20)。肺动脉高压组和MSCs移植组大鼠一次性项背部皮下注射野百合碱(50 mg/kg),复制肺动脉高压模型。三组大鼠同等条件饲养。3周后,MSCs移植组大鼠经舌下静脉注射5×106/ml的经Hoechst 33342标记的MSCs细胞悬液1 ml,肺动脉高压组大鼠予等量L-DMEM液,正常对照组不作任何处理。移植后28 d,观察三组大鼠的平均肺动脉压力(mPAP)、右心指数、血气及肺小动脉的微观结构的改变。结果肺动脉高压模型大鼠用MSCs移植28 d后,该组动物生存率为100%,平均肺动脉压力明显降低、右心指数下降,动脉血气指标等均有明显改善,与肺动脉高压组相比差异有统计学意义(P0.01)。荧光显微镜观察到Hoechst 33342标记的MSCs在肺内定植且分化成大量新生血管并形成侧支循环,肺动脉重构得到有效逆转。结论MSCs移植可有效减轻并逆转野百合碱诱导的肺动脉高压的进程,其治疗作用机制可能与MSCs分化形成新生血管和改善肺小动脉血管重构有关。     

胚胎干细胞诱导分化为造血干细胞重建造血功能的作用

目的探讨胚胎干细胞（ESC）定向分化来源的造血干细胞（HSC）体内重建造血功能的作用。方法将小鼠E14.1胚胎干细胞采用三步诱导法在体外分化发育为HSC,流式细胞仪检测HSC表面标志性抗原CD34^＋/Sca-1^＋的表达,体内畸胎瘤形成实验检测其致瘤性,造血克隆形成（CFU）实验观察其体外造血集落形成情况,免疫磁珠分选纯化HSC移植给经亚致死剂量γ射线照射的雌性小鼠观察其体内重建造血的功能。结果多种造血刺激因子联合应用能有效促进ESC发育为含丰富造血前体细胞的胚胎体（EB）,诱导14 d后,EB中CD34^＋/Sca-1^＋细胞数达峰值,为（13.72&#177;2.07）%。收获此阶段的EB行第二步诱导分化16 d后,CD34^＋/Sca-1^＋细胞数可增至（24.62&#177;2.50）%,CFU培养出现红系和粒系造血克隆;在骨髓基质细胞加胎肝基质细胞上清液培养体系中进行第三步诱导分化15 d后,CD34^＋/Sca-1^＋细胞达峰值,为（58.64&#177;4.20）%,CFU培养能形成较多的红系、粒系/巨噬细胞系及混合细胞集落,W right-G iemsa染色显示为原始的造血细胞。此阶段的HSC经分选纯化后移植给经γ射线照射后的小鼠,移植组小鼠＋10 d造血功能开始恢复,观察40 d后除血小板恢复较慢外,白细胞、红细胞、血红蛋白等指标已接近正常,植入率为71.4%,存活率为43.0%,染色体检测证实已由受体鼠的XX转为供体鼠的XY。结论采用分阶段诱导的方法,可在体外定向诱导小鼠ESC分化发育为HSC,此来源的HSC较安全,无致瘤性,并具备体内重建造血功能的能力。     

野百合碱诱导实验性肺动脉高压的研究

目的:观察野百合碱(crotaline)诱导慢性肺损伤的病理变化及探讨肺动脉高压形成机理.方法:24只SD大鼠一次性皮下注射crotaline 50 mg/kg体重,建立肺动脉高压动物模型.通过光学显微镜观察crotaline对肺动脉血管内皮细胞的损伤和肺部的病理改变,并分析病变之间以及它们与肺动脉高压的关系.结果:注射crotaline可使肺动脉血管内皮细胞损伤,并诱导肺动脉平滑肌明显增生,导致肺动脉血管壁的重建和右心室肥厚.结论:肺动脉血管壁的重建是肺动脉高压的主要病理基础.     

血管内皮细胞作为饲养层细胞对胚胎干细胞的生长支持作用

目的:探讨人脐静脉血管内皮细胞是否可作为饲养层来支持胚胎干细胞的生长,并维持其未分化状态.方法:使用健康产妇剖宫产后遗弃的脐带培养内皮细胞,并进行细胞传代培养和增殖扩增.将脱离饲养层克隆生长良好的E14.1胚胎干细胞接种到经丝裂霉索C(10 mg/L)灭活后的2～5代内皮细胞饲养层上进行传代培养,对培养的胚胎干细胞进行碱性磷酸酶、Oct-4及体内全能分化实验鉴定.结果:E14.1胚胎干细胞在人脐静脉内皮细胞上传3～8代后能较好地保持未分化状态,高度表达碱性磷酸酶及干细胞因子Oct-4;体内全能分化实验显示,在内皮细胞上生长6代和10代以上的E14.1胚胎干细胞被接种到裸鼠6周后,形成含三个胚层的组织细胞畸胎瘤.结论:(1)人脐静脉血管内皮细胞可作为饲养层支持胚胎干细胞的生长;(2)胚胎干细胞在内皮细胞上能保持未分化状态;(3)人脐静脉血管内皮细胞可以作为一种来源丰富,取材方便的人源化饲养层细胞新来源,为胚胎干细胞的临床应用奠定了基础.     

胚胎干细胞诱导分化为造血干细胞重建造血功能的研究

使用胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESC)诱导分化为造血干细胞(hematopoieticstem cells,HSC)解决移植供体来源匮乏是目前国际上研究的热点问题.我们使用小鼠ESC体外定向诱导分化为HSC,并移植给骨髓摧毁模型小鼠,观察重建体内造血的情况,借以评价其功能性.     

人脐静脉血管内皮细胞的培养和鉴定

目的: 建立血管内皮细胞体外培养的模型,为研究内皮细胞提供重要的实验方法.方法: 采用0.1%I型胶原酶消化灌注脐静脉,在37 ℃水浴箱内孵育18～20 min,离心后向沉淀内加入L-DMEM培养液(含10 mg/L内皮细胞生长因子),吹打成单细胞悬液,放入预铺1.5%明胶的培养瓶内,在CO2培养箱中培养,48 h后换液1次,以后每2～3 d换液1次,每天在倒置相差显微镜下观察细胞,免疫组织化学法进行Ⅷ因子相关抗原鉴定.结果: 经胶原酶消化法获得的细胞经过镜下观察和Ⅷ因子相关抗原鉴定证明是脐静脉内皮细胞.结论: 用胶原酶消化法是获得血管内皮细胞的一种好方法,获得的细胞数量多、成活率高.     

骨髓间充质干细胞移植对肺动脉高压大鼠模型肺组织超微结构的影响

肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension,PAH)是一类以肺血管阻力进行性增高为主要特征,最终导致右心衰竭甚至死亡的疾病.肺血管重建是PAH的核心病理机制~([1]).近年来,随着干细胞治疗技术在临床的逐步应用,使用干细胞修复损伤的肺动脉或使其再生,有可能达到根治PAH的效果.本研究通过建立野百合碱(monocrotaline)诱导的大鼠PAH肺血管重构模型,观察骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)移植对肺组织超微结构的影响,探讨MSC移植逆转肺血管重构的机制.