pCDM8-GFP报告载体的构建及鉴定

1　实验资料　ｐＤＭ 8 ＰＢＬｃＤＮＡ文库由Ｊａｃｋｓｏｎ博士惠赠 ,ｐＥＧＦＰ Ｎ3真核表达载体购自Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司 .ＮｏｔＩ、ＨｉｎｄⅢ和Ｔ4ＤＮＡ连接酶购自大连宝生物公司 .ＣＯＳ7细胞为本室冻存。ｐＣＤＭ8 ＧＦＰ载体的构建方法参照文献 .提取 ｐＣＤＭ8 Ｘ(Ｘ表示载体中插入的未知ｃＤＮＡ片段 )和 ｐＥＧＦＰ Ｎ3质粒 ,分别用ＮｏｔＩ和ＨｉｎｄⅢ进行双酶切 ,回收酶切片段 ,用Ｔ4连接酶进行连接 ,转化感受态宿主菌。挑单菌落培养 ,提取质粒用ＮｏｔＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切进行阳性克隆鉴定 .提取重组ｐＣＤＭ8 ＧＦＰ载…     

Rack1敲低促进TGF-β诱导的A549细胞的上皮-间充质转化

目的 研究Rack1分子在TGF-β诱导A549细胞发生上皮-间充质转化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)过程中的功能.方法 制备携带不同Rack1干涉序列的慢病毒颗粒,并感染A549细胞建立稳定细胞系.选取敲低效率较高的细胞系,利用MTS、细胞划痕、免疫印迹等技术检测Rack1敲低后细胞的增殖、TGF-β诱导的迁移及相关分子表达水平的改变.结果 获得了Rack1稳定敲低的细胞系,Rack1敲低后细胞增殖减慢,TGF-β诱导的迁移加快,钙黏蛋白E(E-cadherin)下调和胞外信号调节激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)磷酸化水平升高.结论 Rack1分子敲低促进EMT的发生.     

Smad4 条件基因敲除小鼠听功能初步研究

目的对Smadd条件基因敲除后三种不同基因型小鼠野生型＋／＋、杂合子＋／-、纯合子-／-进行听功能检查。初步确定Smadd条件基因敲除后小鼠的听力学表型特征，、方法对Smad4条件基因敲除后同窝出生的三种不同基因型小鼠野生型＋／＋、杂合子＋／-、纯合子-／-分别进行听性脑干反应（ABR）和听神经复合动作电位（CAP）的检查，判断Smadd条件基困敲除后三种基因型小鼠是否有听力的改变；如果听力有所改变．再将两种方法相结合以综合判断听力改变可能的病理部位。结果各个月龄的Smadd条件基因敲除后的纯合子小鼠各频率的ABR阈值均在100dBSPL以上，有的甚至在最大给声刺激都无法引出可识别的波形。野生型和杂合子小鼠都可以诱发出可辨别、可重复的ABR波形。听神经动作电位的结果与脑干诱发电位结果相似，纯合型小鼠各个频率均未引出动作电位波形，另外两种基因型小鼠可以引出稳定的CAP波形。结论Smadd条件基因敲除后小鼠由于基因的缺陷而出现了重度感音神经性耳聋，纯合子小鼠出现全聋。     

抗人血小板/T细胞活化抗原1(PTA1)不同表位单克隆抗体的制备及鉴定

目的　研制一套可识别 PTA 1分子不同功能性表位的单克隆抗体 (m Ab) .方法　采用亲和层析法从血小板裂解液中纯化的天然 PTA1分子免疫 BAL B/c小鼠 ,以间接 EL ISA筛选阳性杂交瘤 ,并以 PTA1c DNA转染 COS7细胞 ,进行间接免疫荧光染色和流式细胞术鉴定 m Ab的特异性 .竞争结合试验确定 m Ab识别 PTA1分子的表位 .纯化的 PTA1经 SDS- PAGE后 ,转移到 PVDF膜 ,确定 m Ab是否可用于 Western blot.结果　共获得 7株可稳定分泌 m Ab的杂交瘤细胞株 ,分别命名为 FMU 1,FMU2 ,FMU3,FMU4,FMU5 ,FMU6和 FMU7.所有 m Ab…     

一种新的人活化T细胞抗原p140的分布及其功能的研究

目的 观察一种新的活化T细胞膜分子p140的分布、相对分子质量（Mr)和功能。方法 用免疫芝光染色和流式细胞术观察p140分子的分布;采用重导向杀伤实验观察其对杀伤功能的调节;应用生物素标记细胞膜分子、免疫沉淀及化学发光测定p140的Mr。结果 p140分子可选择性地表达于混合淋巴细胞培养（MLC）所产生的活化T细胞表面,而在抗CD3 mAb、PHA、PMA或PMA＋A23187几种刺激剂活化的人外周血单个核细胞（PBMC）上未见表达。p140还分布于一些人急性T细胞性白血病细胞系。在重导向杀伤实验中,p140与CD3分子有协同作用。p140M,为140000。结论 p140可能为一种新的移植抗原诱导的T细胞活化分子,同CD3分子具有协同刺激作用。     

Cre重组酶在软骨组织特异性转基因小鼠中表达的时空分布

目的：检测Cre重组酶在软骨组织特异性Cre重组酶转基因小鼠(Col2al—Cre)表达的时空分布。方法：将Col2al—Cre转基因小鼠和ROSA26报告小鼠杂交，得到的双转基因小鼠中表达Cre重组酶的部位将表达LacZ基因。通过LacZ染色可直接观察不同发育阶段转基因小鼠中Cre重组酶表达的组织特异性。结果：LacZ染色结果显示，骨骼发育早期间充质细胞聚集时Cre重组酶已经在表达Ⅱ型胶原的软骨细胞中行使功能。胚胎期13．5d小鼠的前肢、后肢、脊椎和梅克尔软骨部位LacZ染色阳性。在新生小鼠可见由软骨内成骨形成的骨骼内软骨组织LacZ染色阳性。从新生小鼠的胫骨显微切片可以看到，生长板各区软骨细胞、软骨膜细胞和紧邻生长板干骺端的成骨细胞LacZ染色阳性。结论：我们研制的Col2al-Cre转基因小鼠中Cre重组酶在软骨内成骨过程中所有的软骨细胞中表达，是一种理想的研制软骨组织特异性剔除基因小鼠的工具。     

Cre重组酶在心肌细胞特异性转基因小鼠中的功能检测

目的：检测Cre重组酶在心肌细胞特异性Cre重组酶转基因小鼠（α-MHC-Cre）中的组织分布及其在体内介导基因重组的作用。方法：将α-MHC-Cre转基因小鼠与尺DSA26报告小鼠交配，利用LacZ染色对双转基因阳性子代小鼠进行检测。然后，将α-MHC-Cre小鼠与Smad4条件基因打靶小鼠交配，利用PCR和Southem杂交对Cre重组酶介导重组的组织特异性进行检测。结果：LacZ染色表明，Cre重组酶只在心肌细胞中特异性表达并介导ROSA位点LoxP序列间的重组。PCR和Southem结果显示Cre重组酶只在心肌细胞中特异地剔除了Smad4基因，进一步验证了Cre重组酶在心肌细胞中发挥介导LoxP位点重组的作用。结论：α-MHC-Cre转基因小鼠具有良好的组织特异性，只在心肌细胞中表达Cre重组酶，并能在体内成功地介导心肌细胞基因组上LoxP位点间的重组，是一种理想的研制心肌细胞特异性基因剔除小鼠的工具小鼠。     

抗人血小板/T细胞活化抗原1(PTA1)不同表位单克隆抗体的制备及鉴定

目的 研制一套可识别PTA1分子不同功能性表位的单克隆抗体（mAb)。方法 采用亲和层析法从血小板裂解液中纯化的天然PTA1分子免疫Balb/c小鼠,以间接ELISA筛选阳性杂交瘤,并以PTA1 cDNA转染COS7细胞,进行间接免疫荧光染色和流式细胞术鉴定mAb的特异性。竞争结合试验确定mAb识别PTA1分子的表位。纯化的PTA1经SDS－PAGE后,转移到PVDF膜,确定mAb是否可用于Western blot。结果 共获得7株可稳定分泌mAb的杂交瘤细胞株,分别命名为FMU1,FMU2,FMU3,FMU4,FMU5,FMU6和FMU7。所有mAb与纯化天然PTA1和PTA1／Ig融合蛋白均有良好的免疫反应性,均可识别PTA1 cDNA转染的COS7细胞。流式细胞仪检测阳性荧光峰型与PTA1阳性对照Leo A1 mAb的荧光峰型相似;7株mAb识别PTA1分子的5个不同表位;FMU1,FMU2,FMU4,FMU5,FMU6和FMU7可应用于Westernblot。结论 成功地制备7株抗PTA1分子的特异性mAb。这些mAb可分别识别PTA1的5个表位,为PTA1分子结构与功能的研究提供了新的手段。     

TGF-β超家族分子在软骨内成骨中的作用

转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族分子包括TGF-β、骨形态发生蛋白(BMP)等30多个成员。它们在软骨组织分布广泛，在软骨内成骨的各个阶段皆具有重要功能。TGF-β分子可以促进软骨细胞细胞外基质合成，抑制软骨细胞的肥大分化和矿化。BMP分子可以诱导间充质细胞分化为软骨细胞，促进合成细胞外基质，抑制软骨细胞的终末分化。另外，TGF-β、BMP分子可以和IHH-PTHrP信号通路相互作用协调软骨细胞分化，BMP和FGF分子相互拮抗控制软骨细胞增殖、IHH分子表达和软骨细胞的终末分化。但是，TGF-β超家族分子在软骨内成骨中的详细作用机制仍需进一步的研究来阐明。     

两种新的与移植免疫相关的白细胞分化抗原

白细胞分化抗原 (ｌｅｕｃｏｃｙｔｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｔｉｇｅｎ ,ＬＤＡ)是白细胞分化成熟为不同谱系和分化不同阶段以及活化过程中出现或消失的细胞表面标记[1] 。大多数ＬＤＡ已用ＣＤ加以编号和分类。从 2 0世纪80年代以来 ,ＣＤ编号以及结构和功能的研