乙型肝炎病毒X蛋白对阿霉素诱导的肝癌细胞凋亡及p53、PTEN表达的影响

目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白对阿霉素诱导的肝癌细胞凋亡及p53、PTEN表达的影响.方法 用阿霉素(2.5 μg/ml)分别处理HepG2及稳定表达GFP、GFP-HBx融合蛋白的细胞系HepG2/GFP、HepG2/GFP-HBx,处理后不同时间在显微镜下观察细胞形态变化,流式细胞术检测细胞凋亡;RT-PCR检测p53、PTENmRNA水平;Western blotting检测p53、PTEN蛋白水平.结果 流式细胞术检测显示阿霉素处理后36h,HepG2/GFP-HBx细胞凋亡率为3.94%,明显低于HepG2(59.03%)、HepG2/GFP细胞(61.38%)(P<0.001),而与未处理对照组细胞(2.12%、2.78%、2.55%)无显著差别(P>0.05).RT-PCR分析显示HepG2/GFP-HBx细胞PTEN mRNA水平低于HepG2及HepG2/GFP细胞,而p53 mRNA水平无明显差别.Western blotting检测显示HepG2/GFP-HBx细胞PTEN蛋白明显低于HepG2及HepG2/GFP细胞,而p53蛋白无明显差别.结论 HBVX蛋白能够抑制阿霉素诱导的细胞凋亡及PTEN表达.HBVX蛋白对其细胞凋亡的抑制可能与其对p53-PTEN的抑制有关.     

乙型肝炎病毒HBx蛋白抑制阿霉素诱导的HepG2细胞凋亡

目的探讨乙型肝炎病毒HBx蛋白对阿霉素诱导的肝癌细胞凋亡的影响。方法将adr亚型HBx基因片段定向插入绿色荧光蛋白（GFP）真核表达载体pEGFPCl，构建重组体pGFP—HBx。将pEGFPCl、pGFPHBx转染HepG2细胞，采用G418筛选抗性克隆、荧光显微镜观察及RT—PCR检测HBx基因表达情况以建立稳定表达细胞株HepG2／GFP、HepG2／GFPHBx。用阿霉素（2．5μg／m1）分别处理HepG2、HepG2／GFP、HepG2／GFPHBx细胞，处理后不同时间在显微镜下观察细胞形态变化，并用锥虫蓝染色计数死亡细胞；流式细胞仪检测阿霉素处理36h后细胞凋亡率。结果HepG2／GFP、HepG2／GFPHBx细胞传70代后，仍表达强的GFP；RTPCR检测显示在HepG2／GFP—HBx细胞有HBx基因转录表达。锥虫蓝染色检测表明阿霉素处理的HepG2、HepG2／GFP细胞发生了明显的时间依赖性细胞死亡，而在HepG2／GFPHBx和对照组细胞未见明显细胞死亡；流式细胞仪检测显示阿霉素处理36h后，HepG2／GFP—HBx细胞凋亡率为3．94％，明显低于HepG2（59．03％）、HepG2／GFP细胞（61．38％）（P〈0．01），而与未处理对照组细胞凋亡率（2．12％，2．78％，2．55％）差异无统计学意义（P〉0．05）。结论成功建立了稳定表达GFP、GFPHBx的HepG2细胞株；HBx能够抑制阿霉素诱导的HepG2细胞凋亡。     

抑制EBNA1表达对NK/T细胞淋巴瘤细胞增殖的影响

目的 研究抑制EBV阳性NK/T细胞淋巴瘤细胞系HANK1细胞EBV核抗原1的表达对细胞增殖和周期分布的影响,探讨抑制EBV感染治疗EBV相关性NK/T细胞淋巴瘤的潜在应用价值。方法 用RNA干扰（RNA interference,RNAi）方法抑制HANK1细胞EBNA1表达,Western blot检测EBNA1蛋白表达,流式细胞仪检测细胞周期分布和细胞凋亡。结果EBNA1-shRNA表达载体明显抑制EBNA1表达,细胞周期G₁期停滞,凋亡细胞增多,细胞增殖受抑。结论 根治EBV感染可能是治疗EBV相关性NK/T细胞淋巴瘤的好方法。     

偶发型视网膜色素变性患者CD4+ CD25+调节性T细胞检测

目的 检测偶发型视网膜色素变性(Retinitis Pigmentosa RP)患者外周血中CD4+ CD25+ 调节性T细胞的比例,以观察该病病变过程中是否存在自身免疫因素.方法 临床实验研究.对2007年9月至2009年8月在中山大学附属第三医院眼科抽取3年内病程偶发型RP患者(19例)、3～5年内病程偶发型RP患者(15例)和健康人(22人)外周静脉血.用流式细胞术检测外周血CD4+ CD25+ Treg细胞比例.结果 3年内病程偶发型RP患者外周血CD4+ CD25+ Treg细胞比例(9.41±4.87)%显著低于健康人外周血CD4+ CD25+ Treg细胞比例(13.53±6.28)%,(t=2.795,P<0.05),差异有统计学意义.3～5年内病程偶发型RP患者外周血 CD4+ CD25+ Treg细胞比例(11.17±4.90)%与3年内病程偶发型RP患者及健康人外周血 CD4+ CD25+ Treg细胞比例比较(t值分别为2.795和1.200,P值分别为0.196和2.41,P>0.05),差异无统计学意义.结论 发病早期偶发型RP患者外周血中CD4+ CD25+ Treg存淋巴细胞中所占的比例降低,提示在该病早期存在自身免疫现象,为对该病进行免疫学治疗提供了线索.

Abstract：

Objective To detect ratio of CD4+ CD25+ regulatory T cell in blood of the patients with sporadic type retinitis pigmentosa (RP).Methods Experimental Stndy Peripheral blood of 19 sporadic type RP patients with 3 years course, 15 sporadic type RP patients with 5 years course, and 22 healthy people were collected.The ratio of CD4+ CD25+ T cell was determined by flow cytometry.Results The ratio of CD4+ CD25+ T cell in sporadic type RP patients with 3 years course (9.41± 4.87)% was far lower than that in healthy controller (13.53± 6.28)%, t =2.795, P <0.01.There was no significant difference among the ratio in RP patients with 3～5 years course, in RP patients with less than 3 years course or in healthy controllers.Conclusions The ratio of CD4+ CD25+ T cell in the patients of sporadic type RP decreases in the early stage, mentioning autoimmune factor in the onset of the disease, that provides clue for immunological treatment.     

乙型肝炎病毒X蛋白抑制p16蛋白表达及其促进HepG2肝癌细胞生长

目的 探讨乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)对肝癌细胞生长的影响及其机制.方法 以HepG2细胞和稳定表达GFP/HBx融合蛋白的HepG2/GFP-HBx为实验细胞,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞吸光度值A490,分析细胞生长增殖;流式细胞术检测细胞周期;甲基化PCR检测细胞p16INK4A基因的甲基化;Western blot检测p16蛋白表达水平. 结果 72 h时HepG2/GFP-HBx细胞组的A490为3.225±0.038,分别与HepG2和HepG2-GFP细胞组的2.012±0.022、2.038±0.029比较,增殖能力明显增强,t值分别为46.86和42.51,P值均＜0.001,差异均有统计学意义.流式细胞术检测示HepG2/GFP-HBx细胞组的G0/G1期细胞占16.45％±0.45％,明显低于HepG2和HepG2/GFP细胞组的44.81％±1.36％、42.76％±1.58％,t值分别为-34.22和-28.88,P值均＜ 0.001,差异均有统计学意义.而5-氮-2 '-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)处理的HepG2/GFP-HBx细胞G0/G1期细胞比例为33.25％±0.79％,较未处理HepG2/GFP-HBx细胞组的16.45％±0.45％显著增加,两组比较,t=31.85,P＜0.001,差异有统计学意义.甲基化PCR检测显示HepG2/GFP-HBx细胞组发生了p16INK4A基因甲基化,而HepG2和HepG2-GFP细胞组及5-Aza-CdR处理的HepG2/GFP-HBx细胞组未检测到p16INK4A基因启动子甲基化.Western blot检测示HepG2/GFP-HBx细胞组p16蛋白水平低于HepG2和HepG2/GFP细胞组,而5-Aza-CdR处理HepG2/GFP-HBx细胞后,p16蛋白水平高于未处理的HepG2/GFP-HBx细胞. 结论 HBx蛋白可通过缩短HepG2细胞生长的G0/G1期而加快细胞周期进程,从而促进肝癌细胞生长增殖,其机制可能与HBx蛋白诱导p16INK4A基因启动子甲基化及抑制p16蛋白表达有关.     

重组人IL1-Ra与TGF-β1共转染软骨细胞的基因表达

目的：探讨重组人IL1-Ra与TGF-β1基因转染软骨细胞的表达情况。方法：体外分离培养兔关节软骨细胞，然后用构建的IL1-Ra与TGF-β1质粒通过脂质体介导下共转染软骨细胞，通过荧光显微镜观察转基因的表达和荧光定量PCR检测其表达。结果：荧光显微镜观察有绿色荧光蛋白表达，荧光定量PCR鉴定证实转染的软骨细胞中转基因得到表达。结论：IL1-Ra与TGF-β1基因共转染软骨细胞可以获得表达，为基因治疗骨关节炎的研究提供基础。     

HBV X蛋白对阿霉素诱导的肝癌细胞凋亡的影响

目的：探讨乙型肝炎病毒X蛋白（hepatitis BvirusX protein,HBVX）对阿霉素诱导的肝癌细胞凋亡及p53、PTEN表达的影响。方法：用阿霉素（2.5g/mL）分别处理HepG及稳定表达GFP、GFP-HBVX融合蛋白的细胞系HepG/GFP、22HepG/GFP-HBVX,处理后不同时间在显微镜下观察细胞形态变化,流式细胞术检测细胞凋亡。结果：流式细胞术检测显2示阿霉素处理后36h,HepG/GFP-HBVX细胞凋亡率为3.94%,明显低于HepG（59.03%）、HepG/GFP细胞（61.38%）222（P〈0.05）,而与未处理对照组细胞（2.12%、2.78%、2.55%）无明显差别（P〉0.05）。结论：HBVX蛋白能够抑制阿霉素诱导的细胞凋亡。     

慢性HBV感染患者抗原表位特异性CTL与ALT水平无关

 [目的]通过定量分析慢性乙型肝炎患者体内乙型肝炎病毒（HBV）特异性的细胞毒性T淋巴细胞,探讨特异性细胞毒性T淋巴细胞水平与血清丙氨酸氨基转移酶水平和病毒复制状态的关系.[方法]从慢性乙型肝炎患者外周血分离外周血单个核细胞（PBMC）,用HLA-A2限制的HBcAg抗原表位肽-五聚体复合体及CD8单克隆抗体染色后,用流式细胞仪检测HBV特异性的细胞毒性T淋巴细胞,同时检测患者的肝功能和定量分析HBV DNA.[结果]32例HLA-A2阳性的慢性乙型肝炎患者外周血均可检测到HBV特异性的细胞毒性T淋巴细胞,五聚体阳性细胞占CD8阳性细胞的比例为1.3%±1.1%,统计分析抗原表位特异性细胞毒性T淋巴细胞频率与丙氨酸氨基转移酶水平相关性不显著（r=0.163,P=0.163）.分组对比发现病毒载量低者（HBV DNA定量＜105拷贝/mL）抗原表位特异性细胞毒性T淋巴细胞水平（1.96%±1.26%）高于病毒载量高者（0.82%±0.52%,P＜0.05）.[结论]慢性乙型肝炎患者外周血中存在抗原表位特异性细胞毒性T淋巴细胞,抗原表位特异性细胞毒性T淋巴细胞可能与控制HBV的复制有关,但主要肝损害并非直接由抗原表位特异性细胞毒性T淋巴细胞引起.     

γδT细胞、调节性T细胞、白细胞介素17及转化生长因子β1在变应性鼻炎患者外周血中的表达

目的 探讨变应性鼻炎(allergic rhinitis,AR)患者外周血中γδ T细胞、调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)、白细胞介素(interleukin,IL) 17及转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)的表达及临床意义.方法 2012年3-7月,收集32例AR患者(AR组)和20例健康志愿者(对照组)的外周血,采用流式细胞术检测外周血中γδ T细胞和Treg细胞比例;酶联免疫吸附试验检测血清中IL-17、TGF-β1的水平,并分析它们之间的相关性.采用SPSS 16.0软件进行数据分析.结果 γδ T细胞百分比在AR组和对照组分别为(13.30±8.62)％、(5.18±1.86)％,差异有统计学意义(t =5.18,P＜0.01);Treg细胞百分比分别为(1.75±0.56)％、(4.76±1.74)％,差异有统计学意义(t =7.46,P＜0.01).AR组血清中IL-17的表达水平为(668.55 ±45.15) pg/ml,高于对照组的(573.53±17.42) pg/ml,差异有统计学意义(t=8.97,P＜0.01);AR组TGF-β1的表达水平为(0.34±0.04) pg/ml,低于对照组的(0.49 ±0.06) pg/ml,差异有统计学意义(t=9.51,P＜0.01).AR组患者外周血中γδ T细胞百分比与Treg细胞百分比呈负相关趋势(r=-0.561,P＜0.01),γδ T细胞百分比与IL-17呈正相关趋势(r=0.469,P＜0.01),γδ T细胞百分比与TGF-β1呈负相关趋势(r=-0.622,P＜0.01),Treg细胞百分比与TGF-β1呈正相关(r=0.738,P＜0.01),IL-17表达水平与Treg细胞百分比、TGF-β1无相关性(r值分别为-0.111、-0.196,P＞0.05).结论 AR患者外周血中γδ T细胞和Treg细胞之间存在免疫平衡失调,γδ T细胞可能参与了IL-17的分泌,这可能在AR的发病和发展过程中发挥重要作用.     

重型肝炎患者血小板形态学及线粒体膜电位的变化

目的观察重型肝炎患者血小板形态学及线粒体膜电位的变化,探讨血小板功能缺陷的可能机制。方法重型肝炎及健康自愿者各20名,观测2组血小板形态学参数(Plt、体积、血小板分布宽度、血小板压积)及血小板线粒体膜电位水平。肝脏损害的相关指标及凝血功能亦被观测。结果重型肝炎患者凝血酶原时间(25.08±7.45)、活化部分凝血活酶时间(56.42±12.50)明显延长。与正常对照组相比,重型肝炎患者Plt(79.3±44.0 vs222.5±47.9)、血小板压积(0.08±0.04 vs 0.22±0.05)明显降低,但平均血小板体积(11.19±1.02 vs 9.89±0.90)增大;重型肝炎患者血小板线粒体膜电位水平(0.72±0.19)较正常对照组(0.59±0.16)增高。结论重型肝炎患者血小板减少,其形态学及线粒体膜电位水平与正常对照组显著不同;血小板线粒体膜电位水平增高可能是血小板功能缺陷的机制之一。