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目的获得具有生物学活性的SARSN蛋白的模拟肽。方法以抗SARS病毒N蛋白的单克隆抗体作为固相筛选分子,免疫筛选噬菌体随机十二肽库,并采用夹心ELISA、竞争抑制试验鉴定阳性克隆。结果经噬菌体富集后,从随机筛选的各46个克隆中得到N蛋白的2个不同表位,即由ELISA鉴定出单克隆抗体C00835个阳性克隆,确定氨基酸序列GXLXTPXXXXGT为SARSN蛋白的一个表位;单克隆抗体C03941个阳性克隆,确定氨基酸序列TTLPXXXXAXXX为SARS病毒N蛋白的另一个表位。结论用噬菌体随机12肽库成功筛选得到SARSN蛋白的2个不同模拟表位,为用SARS表位去探索其病毒的结构及疫苗的研制创造了条件。 相似文献
3.
目的在大肠杆菌中表达一种新近发现的抗凋亡蛋白Fortilin。方法用RT-PCR方法,从肺腺癌细胞中扩增出编码Fortilin蛋白的基因(GenBank中编码该蛋白的基因名为TPT1),克隆入pGEX-4T-1表达载体;重组质粒转入E.coliBL21(DE3),诱导表达Fortilin蛋白,并对表达产物进行免疫印迹鉴定。结果经双酶切及核酸序列分析鉴定,重组质粒pGEX-4T-1/TPT1成功构建,诱导后能高效表达可溶性Fortilin融合蛋白,SDS-PAGE及Western-blot验证该蛋白,表达的融合蛋白分子量为45000,与预期理论值相符。结论Fortilin蛋白在大肠杆菌中以融合蛋白形式进行表达,可提高其在宿主细胞中的稳定性和可溶性,且在大肠杆菌中获得高效表达,获得了充足的活性蛋白,这为进一步了解该蛋白的生物学功能,研究其抗凋亡机制奠定了基础。 相似文献
4.
目的 建立通过单次细胞融合制备抗复合抗原(多种抗原)单克隆抗体的方法。方法 用复合抗原(甲胎蛋白、癌胚抗原、乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎核心抗原、乙型肝炎e抗原)免疫BALB/c小鼠,采用常规杂交瘤技术制备单克隆抗体。通过Protein-G亲和层析纯化阳性杂交瘤细胞株腹水,并通过亚类试剂盒法和非竞争ELISA法分别测定抗体亚类和亲和常数,同时应用免疫印迹分析其特异性。结果 通过单次细胞融合共获得20株抗上述复合抗原的单克隆抗体,其中针对甲胎蛋白的单克隆抗体5株、针对癌胚抗原的单克隆抗体6株、针对乙型肝炎表面抗原的单克隆抗体3株;针对乙型肝炎核心抗原的单克隆抗体4株、针对乙型肝炎e抗原的单克隆抗体3株。已鉴定的部分阳性杂交瘤细胞株亚类均为IgG1,抗体亲和常数介于1×109M-1~2.8×1011M-1,免疫印迹分析显示,所获得的单抗都与其抗原发生特异性结合。结论 建立了通过单次细胞融合制备针对复合抗原的单克隆抗体制备技术,使单克隆抗体的产出率显著提高,制备周期明显缩短,为建立规模化单克隆抗体制备平台奠定基础。 相似文献
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目的制备抗PSMD10的单克隆抗体(McAb),并对其特异性进行鉴定。方法用柱层析纯化的重组PSMD10蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备McAb,用ELISA和有限稀释法筛选出分泌高滴度McAb的杂交瘤细胞株,用Protein-G亲和层析纯化接种杂交瘤细胞的小鼠腹水,测定其免疫球蛋白亚类及其效价,Western-blot分析其特异性。通过免疫组织化学染色法检测PSMD10在肝细胞肝癌组织中的表达部位。结果筛选出2株能稳定分泌抗PSMD10单克隆抗体的杂交瘤细胞株,单抗均为IgG2,Western-blot分析显示,2株单抗都与重组的PSMD10发生特异性结合。免疫组织化学染色分析显示,PSMD10表达在肝细胞肝癌的细胞浆内。结论制备的抗PSMD10杂交瘤细胞株能分泌高滴度和高特异性的单克隆抗体,可望用于进一步研究肝细胞肝癌的发生发展、诊断和治疗。 相似文献
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目的建立恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶(GDH)融合蛋白质的复性和纯化方法。方法将含有恶性疟原虫GDH全长基因的融合蛋白表达质粒GDH/ pGEX-4T-1转化到宿主菌BL21,该GDH/GST融合蛋白在IPTG的诱导下获得高水平的表达,经SDS-PAGE分析表达产物主要为不溶性的包涵体。经超声酶解法、离心、变性剂/去污剂洗涤后获得包涵体。包涵体经8 mol/L尿素变性后分别采用分子筛柱层析、透析和稀释3种方法复性,并通过浊度分析、非还原SDS-PAGE等方法比较、优化复性方法和条件。复性后的GDH/GST融合蛋白经过不同柱层析方法进行纯化。结果经SDS-PAGE分析表明,GDH/GST融合蛋白表达量可占到菌体总蛋白的25%左右;浊度分析表明:稀释复性法优于其它两种方法,同时20 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA、pH8.5及GSSG/GSH=1∶10为该融合蛋白稀释复性的最佳条件,其复性回收率可达90%以上。复性产物采用二步阴离子交换层析可获得较好的纯化效果。结论通过稀释复性,二步阴离子交换层析可获得高纯度、具有天然空间构象的重组GDH/GST融合蛋白。 相似文献
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目的 利用GST融合基因表达系统表达幽门螺杆菌Catalase/GST融合蛋白,并利用凝血酶柱上切割GST标签.方法 将重组表达质粒Catalase/pGEX-4T-1转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态中并用IPTG进行诱导表达,菌体经反复冻融、溶菌酶裂解及超声破菌进行裂解.采用谷胱甘肽琼脂糖树脂Glutathione Sepharose 4B对Catalase/GST融合蛋白可溶性表达上清进行纯化,并同时利用凝血酶柱上切割GST标签,用鼠抗Catalase抗体对纯化产物进行Western blot鉴定.结果 高效表达出相对分子质量约85 kDa的Catalase/GST融合蛋白,以部分可溶性的形式表达,凝血酶柱上成功地切割了GST标签,Catalase蛋白能被鼠抗Catalase单克隆抗体识别.结论 成功表达了Catalase/GST融合蛋白并柱上切割了GST标签,为深入研究Catalase的功能奠定了基础. 相似文献
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目的构建SARS冠状病毒N蛋白的原核表达质粒,诱导重组蛋白表达并纯化,鉴定其抗原性。方法以我国SARS冠状病毒GDH株总RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增N蛋白的全长基因,TA克隆后测序。构建pET-23d的N基因表达载体,用IPTG诱导目的蛋白表达,利用硫酸铵沉淀、分子筛层析及离子交换层析纯化重组蛋白,免疫印迹鉴定重组蛋白。结果RT-PCR扩增出1269bpSARS冠状病毒N蛋白的基因片段,其序列分析结果与SARS-CoVGD01、BJ01株的同源性为99.92%;该基因在大肠杆菌表达系统中高效表达,占可溶性蛋白的33.57%,表达产物为非融合的可溶性蛋白,Westernblot结果显示重组N蛋白具有良好的抗原性;纯化后重组N蛋白纯度为92.9%。结论成功构建了SARS冠状病毒N蛋白的重组表达质粒,并在大肠杆菌中以非融合蛋白的形式得到高效的可溶性表达,为SRAS的诊断和疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
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目的研究内含子和5'非翻译区对血小板生成素(TPO)基因表达的影响。方法以中国人胎肝mRNA为模板,应用RT-PCR和长距离PCR(LD-PCR)技术扩增了约1.1kb的全长人TPOcDNA,6.2kb的TPO基因组DNA和TPO基因组中的内含子Ⅰ,内含子Ⅱ~Ⅳ和内含子Ⅴ。结果全序列分析表明,全部的编码序列、所有的内含子/外显子剪切部位序列同已知一致,个别差异发生在内含子中。结论通过PCR扩增技术,成功地从中国人胎肝组织中克隆了全长人TPOcDNA、TPO基因组DNA及其全部的内含子。 相似文献