欧压法治疗鼻咽癌放疗后分泌性中耳炎临床观察

目的鼻咽癌放疗后分泌性中耳炎是耳科临床上最常见的并发症,易导致耳闷胀痛、耳鸣、听力下降、头昏头痛,症状易反复,严重者影响正常生活质量,目前治疗方法较多,临床疗效欠佳,为了更有效更好地治疗分泌性中耳炎,总结选用最有效的治疗方法。方法近5年来对123例鼻咽癌放疗后分泌性中耳炎患者选用鼓膜穿刺欧压法鼓室中耳加压给药治疗,其中男性87例、女性36例;双耳105例、单耳18例;欧压法外加压使药物将鼓室及乳突气房咽鼓管内分泌物置换冲冼出来,特别是粘稠胶冻样分泌物。结果患者自觉症状消失,听力提高,经5～15次治疗后鼓室穿刺抽吸无渗出液,穿刺点愈合。查电测听气骨导在20～30 dB内,声阻抗为A型曲线图,临床观察3～6个月无复发者为痊愈。结论通过欧压法外加压使药物将鼓室及乳突气房咽鼓管内分泌置换清除干净,并使药物直接作用于鼓室及乳突气房咽鼓管病变黏膜上皮组织使其恢复正常生理功能。     

hTERTp/TK/pGL3靶向抑制端粒酶活性及其对鼻咽癌干细胞的杀伤作用

［摘 要］ 目的:探讨hTERTp/TK/pGL3载体靶向抑制端粒酶活性及其杀灭鼻咽癌CD133+干细胞的作用机制。方法:将已构建的hTERTp/TK/pGL3载体及其对照处理因素（CMV/TK/pGL3和TK/pGL3载体）转染至鼻咽癌CD133+干细胞、CD133－肿瘤细胞、人脐静脉内皮细胞(ECV)(对照组)和鼻咽癌SUNE未分选细胞中,采用Stretch PCR 法检测4种细胞端粒酶活性改变。MTT法测定CD133+干细胞和ECV细胞存活率。结果:CD133+鼻咽癌干细胞体外培养7 d后细胞逐渐增多,CD133+鼻咽癌干细胞体内成瘤实验阳性。CD133+鼻咽癌干细胞转染hTERTp/TK/pGL3或CMV/TK/pGL3后端粒酶活性降低;而ECV细胞端粒酶为阴性表达;CD133+鼻咽癌干细胞分别转染TK/pGL3、CMV/TK/pGL3和hTERTp/TK/pGL3后细胞存活率平均为（87.4±0.4）％、（20.5±0.4）％和（27.9±0.2）％,ECV对照细胞组转染TK/pGL3、CMV/TK/pGL3和hTERTp/TK/pGL3后细胞存活率平均为（90.7±0.1）％、（18.1±0.2）％和（86.2±0.1）％,hTERTp/TK/pGL3杀灭鼻咽癌CD133+干细胞效率明显高于ECV细胞组（P<0.01）。结论:hTERTp/TK/pGL3载体可以通过下调端粒酶活性靶向抑制端粒酶阳性的鼻咽癌CD133+干细胞。     

人鼻咽癌细胞株中类肿瘤干细胞的分离、培养及鉴定

目的检测CD133在人鼻咽癌细胞株SUNE中的表达以及CD133^＋肿瘤细胞的体外增殖、分化情况,并对其进行类肿瘤干细胞的鉴定。方法采用免疫荧光细胞化学技术及流式细胞仪检测鼻咽癌细胞株SUNE中CD133的表达情况以及CD133^＋细胞体外分化能力;免疫磁珠分选技术纯化CD133^＋肿瘤细胞;MTT法检测CD133^＋细胞的体外增殖能力,并将其与CD133^-及未分选细胞进行比较。结果鼻咽癌细胞株SUNE中有0.35%的微量细胞呈CD133^＋表达;免疫磁珠富集的CD133^＋肿瘤细胞在无血清培养基中悬浮生长,并可以形成肿瘤细胞球,具有很强的自我更新和繁殖能力,且在3、5、7 d的紫外吸光度（A）值分别为0.317&#177;0.007、0.370&#177;0.002、0.558&#177;0.004,均高于相同条件下未分选细胞和CD133^-细胞（P〈0.05）;CD133^＋细胞在含血清培养基中的比例逐日下降,至培养的第12天,由第1天的89.67%下降至0.37%。结论CD133可作为鼻咽癌类干细胞的标志之一。鼻咽癌细胞株SUNE中存在类肿瘤干细胞,并具有自我更新和分化能力。     

增强型胸苷激酶基因表达载体的构建及其杀伤鼻咽癌细胞的实验研究

目的 探讨改良构建人端粒酶催化亚单位(human telomerase catalytic subunit promoter,hTERT)启动子及巨细胞病毒原核(cytomegalovirus,CMV)增强子联合调控单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(thymidine kinase,TK)的增强型表达载体在鼻咽癌细胞体内外实验中的靶向杀伤效应及体内应用的安全性评价.方法 以pGL3-basic空载体为模板,分别酶切连接hTERT启动子、CMV增强子及TK基因构建靶向性增强型表达载体pGL3-basic-EGFP-TK-hTERTp-CMV(以hTERT单启动子调控TK基因表达载体作为对照组),转染端粒酶阳性的人鼻咽癌5-8F细胞及用做对照组的人乳腺癌MCF-7细胞和端粒酶阴性的正常人脐静脉内皮细胞ECV-304,分别采用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达差异、实时荧光定量PCR检测转染后TK基因mRNA表达差异、TeloChaser法检测上述细胞中的端粒酶活性、四甲基偶氮唑蓝(MTt)联合Boyden小室实验分析增强型载体对鼻咽癌细胞增殖及侵袭抑制的作用.将鼻咽癌细胞接种于裸鼠腋部皮下,构建裸鼠鼻咽癌移植瘤模型,研究增强型载体对裸鼠移植瘤的体内生长抑制作用及对全身的毒副反应情况.结果 ①成功改良构建hTERT/CMV双调控TK基因的增强型表达载体.②转染增强型载体组及单启动子载体组的鼻咽癌5-8F细胞均有绿色荧光表达,但前者荧光数量及强度均较后者强,对照组端粒酶阳性的乳腺癌细胞也有很强的荧光表达,而ECV-304细胞几乎无绿色荧光表达.实时荧光定量PCR结果显示,增强型载体组的TK基因mRNA表达量是单启动子组的2-5倍.③ TeloChaser法结果显示,两种肿瘤细胞(5-8F细胞、MCF-7细胞)端粒酶活性均为阳性,正常对照ECV-304细胞端粒酶活性为阴性.④MTT联合Boyden小室侵袭实验结果显示,增强型表达载体对5-8F细胞体外增殖及侵袭力均有明显抑制作用.相对细胞存活率为37.0%,较对照组明显低(P<0.01).⑤体内实验结果显示,增强型靶向表达载体对裸鼠鼻咽癌移植瘤生长具有明显抑制作用,抑瘤率达56.3%,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01),而裸鼠肝肾病理检查未发现明显损害.结论 以hTERT/CMV双调控机制介导TK基因的增强型表达载体能够高效、靶向杀伤鼻咽癌细胞及移植瘤,实验动物体内应用无明显毒副作用.     

靶向增强型TK表达载体在鼻咽癌细胞中的作用研究

目的探讨hTERT启动子及CMV增强子双调控机制的增强型表达载体pGL3-bas-ic-EGFP-TK-hTERTp-CMV enhancer在鼻咽癌细胞中的靶向杀伤效应。方法构建靶向性增强型hTERT启动子及CMV增强子双调控TK表达载体pGL3-basic-EGFP-TK-hTRETp-CMV enhancer,并以单启动子载体pGL3-basic-EGFP-TK-hTRETp作为对照组,分别转染端粒酶阳性的人鼻咽癌细胞株5-8F、人乳腺癌细胞MCF-7（阳性对照）及正常人血管内皮细胞ECV（阴性对照）。荧光显微镜下观察其TK基因绿色荧光蛋白表达,实时荧光定量PCR方法检测转染细胞中TK基因mRNA定量表达差异,Stretch PCR法检测肿瘤细胞端粒酶活性,MTT法分析杀灭鼻咽癌细胞的效果等作为检验指标。结果①该增强型表达载体转染5-8F细胞及MCF-7细胞后的绿色荧光表达及TK基因的mRNA表达均强于单启动子pGL3-basic-EGFP-TK-hTRETp组;而ECV细胞只有极微弱的绿色荧光和极弱的TK基因的mRNA表达。实时荧光定量PCR显示,增强型载体组A值较对照组单启动子组明显增高,是单启动子组的2～5倍。StretchPCR法检测转染前后5-8F细胞端粒酶活性明显被抑制。②加入GCV后增强载体组对鼻咽癌5-8F细胞及乳腺癌MCF-7细胞体外增殖均有明显抑制作用,均高于单启动子载体组、不加GCV的增强型载体组、空载体组及空白对照组。结论以hTERT启动子及CMV增强子双调控机制介导TK基因的新型靶向增强型表达载体能够高效靶向性杀灭鼻咽癌细胞,这种新型高效靶向增强型载体有可能成为一种针对包括鼻咽癌在内的具有较为广泛抗癌谱的恶性肿瘤临床靶向基因治疗的新策略。     

hTERT启动子调控TK基因靶向性杀伤鼻咽癌移植瘤的实验研究

目的 研究人端粒酶反转录酶(hTERT)基因核心启动子调控的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/更昔洛韦(HSV-TK/GCV)系统对鼻咽癌移植瘤的体内杀伤作用. 方法 采用培养细胞移植法,将人鼻咽癌细胞系C666-1接种于裸鼠腋部皮下,建立裸鼠人鼻咽癌移植瘤模型.将40只裸鼠随机分为5组:hTERTp/HSV-TK/PGL3/GCV组、CMV/HSV-TK/PGL3/GCV组、HSV-TK/PGL3/GCV组、GCV组及生理盐水组,每组8只.采用脂质体介导,进行瘤内直接注射,同时经腹腔给予GCV治疗,观察各组裸鼠生存状况及肿瘤相对体积、抑瘤率,并进行荷瘤裸鼠肝肾组织的常规病理检查. 结果 成功构建了 C666-1裸鼠皮下移植瘤动物模型,hTERTp/HSV-TK/PGL3/GCV组移植瘤被明显抑制,抑瘤率达到45.51%,与HSV-TK/PGL3/GCV组、GCV组及生理盐水组(抑瘤率分别为5.52%、14.31%、0.03%)比较有显著性差异(P＜0.01),肝肾病理检查发现,该组裸鼠肝肾均无明显病理学变化.CMV/HSV-TK/PGL3/GCV组的抑瘤率亦达到51.56%,但病理检查发现裸鼠出现肝肾毒性. 结论 hTERT启动子调控TK基因靶向治疗系统能够在体内特异性杀伤鼻咽癌移植瘤,而无明显全身毒副作用,是一种安全、有效的肿瘤靶向基因治疗系统,将为鼻咽癌临床基因治疗开辟新领域.     

hTERT及CMV双调控TK基因靶向杀灭鼻咽癌细胞的实验研究

目的 探讨hTERT启动子及CMV增强子双调控表达载体调控TK基因靶向杀灭鼻咽癌细胞的效应.方法 将双调控增强型载体及hTERT单启动子载体(作为对照组)分别转染两种端粒酶(+)的人鼻咽癌5-8F细胞及对照组人乳腺癌MCF-7细胞及端粒酶(-)的正常人血管内皮ECV细胞,Stretch PCR法验证5-8F细胞、MCF-7细胞及ECV细胞中端粒酶活性,荧光显微镜下观察TK基因绿色荧光蛋白表达差异,MTT法分析杀灭鼻咽癌细胞的效果.结果 ①Stretch PCR法验证人鼻咽癌细胞5-8F、人乳腺癌细胞MCF-7端粒酶活性星阳性,人血管内皮ECV细胞端粒酶活性呈阴性.②增强型表达栽体转染上述两种端粒酶(+)肿瘤细胞均有很强的荧光表达及TK基因的mRNA表达,单启动子亦有较强的荧光表达,但比增强型表达载体要弱,而ECV细胞几乎无绿色荧光.③加入GCV后,增强型表达载体对两种端粒酶(+)肿瘤细胞体外增殖均有明显抑制作用,且均高于单启动子组、空载体组及空白对照组,而增强型表达载体转染ECV细胞体外增殖无明显抑制作用.结论 以hTERT启动子及CMV增强子双调控TK基因的表达载体能够靶向杀灭鼻咽癌细胞,且作用明显强于单启动子载体组.这种新型高效、靶向增强型载体有可能成为一种鼻咽癌临床靶向基因治疗的新策略.     

鼻咽癌细胞中增强型表达载体调控TK基因与端粒酶活性关系的研究

目的:探讨人端粒酶催化亚单位(hTERT)基因核心启动子和原核增强子CMV联合调控单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/更昔洛韦系统对TK基因的活性改变及与鼻咽癌细胞中端粒酶活性的关系。方法:将改良构建后的增强型载体pGL3-basic-EGFP-TK-hTRETp-CMV enhancer及单启动子载体pGL3-basic-EGFP-TK-hTRETp(作为对照组)分别转染端粒酶阳性的人鼻咽癌5-8F细胞株及对照组细胞人乳腺癌MCF-7细胞(端粒酶阳性)及正常人血管内皮ECV细胞(端粒酶阴性),采用荧光显微镜下观察其TK基因绿色荧光蛋白表达,实时荧光定量PCR方法检测转染细胞中TK基因mRNA定量表达差异,TRAP银染法检测肿瘤细胞转染前后端粒酶活性改变并分析TK基因表达与端粒酶活性之间的关系。结果:①增强型表达载体转染鼻咽癌5-8F细胞及乳腺癌MCF-7细胞均有很强的荧光表达及TK基因的mRNA表达,比单启动子pGL3-basic-EGFP-TK-hTRETp及ECV细胞绿色荧光要强。实时荧光定量PCR显示,增强型载体组A值亦较对照组明显增高。②转染增强型载体(加GCV)后TRAP银染法检测鼻咽癌5-8F细胞端粒酶活...