基因组导向的丝状真菌沉默生物合成基因簇激活策略D

真菌是药物先导结构的重要来源,得益于基因组测序技术的飞速发展,生物信息学分析发现真菌中存在大量次级代谢产物基因簇。而这些基因簇在常规实验室培养条件下往往不表达代谢产物,被称之为“沉默”基因。同时,随着天然产物分离技术在日益进步,结构新颖的天然产物发现的几率却在减少。因此如何借助基因组数据分析并激活沉默的基因簇,“解密”天然产物的宝藏,挖掘真菌潜在的代谢潜能成为研究热点。本文主要介绍了基因组导向的丝状真菌沉默生物合成基因簇的激活策略。     

通过阻断GntR家族调控基因ygrA挖掘海洋链霉菌Streptomyces sp. OUC6819中抗MDR菌活性次级代谢产物

激活南海红树林来源链霉菌Streptomyces sp.OUC6819菌株中不表达或表达量低的隐性生物合成基因簇,挖掘具有优良多重耐药菌（MDR）抗菌活性的次级代谢产物。方法 通过生物信息学分析推测Streptomyces sp.OUC6819基因组中可能的GntR家族调控子,采用PCR-targeting策略敲除其中的ygrA基因,HPLC分析突变株和野生株的发酵产物的差异,并比较粗提物对5株MDR菌抑制活性。结果 HPLC分析结果表明与野生株相比,突变株中化合物1和化合物2产量分别产量提高了9倍和7倍;突变株发酵液粗提物对其中3株MDR菌抑制活性较野生株明显提高。结论 通过阻断GntR家族调控子ygrA激活了Streptomyces sp.OUC6819菌株中具有抗MDR菌活性次级代谢产物合成基因簇的表达,为从中发掘新的抗MDR菌抗生素奠定了必要基础;同时,将为其他海洋链霉菌中隐性基因簇的激活提供重要参考。     

红树林放线菌Streptomyces sp.CHQ-61产生的胞外多糖结构及自由基清除活性

目的 探究红树林放线菌Streptomyces sp.CHQ-61产生的胞外多糖的结构及自由基清除活性。方法 利用乙醇沉淀法、阴离子交换层析柱和凝胶层析柱对菌株发酵产物中的胞外多糖进行分离纯化,运用核磁共振、气质联用色谱、红外光谱、高效凝胶渗透色谱和柱前衍生高效液相色谱分析鉴定多糖的结构特征,采用DPPH、超氧阴离子和羟基自由基清除率评价胞外多糖的抗氧化活性。结果 从红树林放线菌Streptomyces sp.CHQ-61发酵产物中分离得到多糖XH-1,其分子量为8.9 kDa,丙酮酸含量为4.0 %,主要由半乳糖和氨基葡萄糖组成,糖链主要含有(1→6)Galp,还有少量的(1→3)GlcNp、(1→4,6)Galp、(1→3,6)GlcNp、末端Galp和GlcNp,XH-1具有一定的体外自由基清除活性,其清除DPPH、超氧阴离子和羟基自由基的EC50分别为0.5、0.8和3.0 mg/mL。结论 本文首次报道了红树林根泥放线菌Streptomyces sp.CHQ-61产生的胞外多糖XH-1为1种含有丙酮酸的半乳糖和氨基葡萄糖组成的结构新颖的胞外多糖,其具有较强的体外自由基清除活性。     

乙型肝炎相关性肝硬化患者血清circMTO1表达水平及其与肝纤维化程度、预后的相关性

目的 分析乙型肝炎相关性肝硬化患者血清环状RNA线粒体tRNA翻译优化因子1(circMTO1表达水平及其与肝纤维化程度、预后的关系。方法 纳入115例乙型肝炎相关性肝硬化患者（乙肝肝硬化组）及120例慢性乙型肝炎患者（慢乙肝组）作为研究对象。根据治疗后短期预后情况,将乙肝肝硬化组患者分为预后良好组（n=84）与预后不良组（n=31）。比较乙肝肝硬化组与慢乙肝组之间、预后良好组与预后不良组之间的血清circMTO1表达水平。分析乙肝肝硬化组血清circMTO1表达水平与肝纤维化分级的相关性。采用受试者工作特征曲线分析血清circMTO1表达水平对乙肝肝硬化组患者不良预后的预测价值。结果 乙肝肝硬化组患者的血清circMTO1表达水平低于慢乙肝组,预后不良组患者的circMTO1表达水平低于预后良好组（P<0.05）。乙肝肝硬化组患者血清circMTO1表达水平与肝纤维化分级呈负相关（P<0.05）。血清circMTO1表达水平预测乙肝肝硬化组患者预后不良的曲线下面积为0.747,敏感度为77.40%,特异度为77.40%,最佳截断值为0.332。结论 与未发生肝硬化的慢性乙型肝炎患者相比,乙型肝炎相关性肝硬化患者的血清circMTO1表达水平降低,且其与肝纤维化程度相关。circMTO1或可作为评估乙型肝炎相关性肝硬化患者预后的分子标志物。     

南海冷泉沉积物来源真菌Penicillium guanacastense HDN20-0005次级代谢产物研究

目的 研究南海冷泉来源真菌Penicillium guanacastense HDN20-0005的次级代谢产物。方法 优化菌株培养条件,运用硅胶柱层析、ODS反相柱层析和半制备高效液相色谱法(HPLC)对其发酵产物进行分离提纯,通过质谱(MS)、核磁共振波谱(NMR)、计算ECD、DP4+分析及和已报道文献比对,对化合物结构进行解析,并进行抑菌活性评价。结果 从该菌株中分离得到1个新的酸酐类化合物(R,Z)-3-ethyl-6-methyl-3,4-dihydro-2H-1,4-oxazocine-2,5,8-trione(1),1个新的色酮衍生物(E)-6,7-dihydroxy-3-(3-oxobut-1-en-1-yl)-4H-chromen-4-one(2),1个已知色酮衍生物penialidin F(3)和1个已知化合物pencolide(4)。评价了化合物1～4对7种真菌和细菌的抑制活性,结果表明化合物均无抑菌活性。此外,评价了新化合物1和2的黄嘌呤氧化酶抑制活性,结果显示化合物2具有微弱的黄嘌呤氧化酶抑制活性,抑制率为（13.16 ± 1.57）%。     

红树林植物内生真菌Stachybotrys chartarum HDN16-358次级代谢产物研究

目的 对红树林植物内生真菌Stachybotrys chartarum（HDN16-358）进行次级代谢产物的研究。方法 利用薄层色谱层析（TLC）,反相ODS,Sephadex LH-20、半制备型HPLC等色谱学方法对菌株发酵粗提物进行分离纯化;利用NMR、MS、UV等波谱学技术手段,解析确定化合物的结构,并对新天然产物1进行了细胞毒活性筛选。结果 分离鉴定了5个单体化合物：(2S)-5-Hydroxy-2,7-dimethyl-2-(4,8-dimethyl-3E,7-nonadienyl)-2H-chromene-6-carbaldehyde (1),BR-011 (2),LL-Z 1272β (3) and stachybotrylactone (4),5-Methylbenzene-1,3-diol (5)。结论 红树林来源真菌是重要活性物质来源和生物资源。从红树林植物内生真菌Stachybotrys chartarum中分离得化合物1-5,化合物1首次从自然界中分离得到,且具有中等细胞毒活性。     

南极海绵共附生真菌Talaromyces sp. HDN1820200次级代谢产物研究

目的对南极海绵共附生来源真菌Talaromyces sp.HDN1820200的次级代谢产物进行研究。方法对菌株发酵液粗提物利用柱层析(VLC,ODS)、凝胶分子筛(LH-20)以及半制备高效液相(MPLC)等方法进行次级代谢产物的分离纯化;利用现代波谱学方法(核磁共振NMR、圆二色谱ECD、红外光谱IR等)对化合物进行结构鉴定。结果分离鉴定了8个单体化合物:(2E,4E,6E)-4-methyldodeca-2,4,6-trienoic acid(1)、(2E,4Z,6E)-4-methyldodeca-2,4,6-trienoic acid(2)、Herbaridine B(3)、Kasanosin C(4)、Citrinolactone A(5)、Citreorosein(6)、1,5,8-trihydroxy-3-(hydroxymethyl)anthracene-9,10-dione(7)和Rugulosin B(8)。结论从南极海绵来源真菌Talaromyces sp.HDN1820200中分离得到了化合物1~8,其中化合物1和2为新化合物,属于脂肪酸类化合物,无明显细胞毒活性。     

多效调控基因wblAyo对海洋链霉菌Streptomyces youssoufiensis OUC6819次级代谢产物及形态分化的影响

目的 激活南海红树林来源的链霉菌Streptomyces youssoufiensis OUC6819中不表达或表达水平低的隐性基因簇,进一步挖掘新颖的次级代谢产物。方法 采用PCR-targeting策略敲除WhiB-like（Wbl）家族的wblAyo基因,通过HPLC分析野生株和突变株发酵产物的差异,检测发酵液粗提物和C18开放柱层析组分对5种多重耐药（MDR）菌（Staphylococcus aureus CCARM 3090, Salmonella typhimurium CCARM 8250, Escherichia coli CCARM 1009, Enterococcus faecium CCARM 5203,Enterococcus faecalis CCARM 5172）的抑制活性,通过固体平板实验和光学显微镜观察链霉菌形态分化的改变。结果 得到了正确的ΔwblAyo阻断突变株,HPLC分析结果表明：与野生株相比,突变株中化合物峰1和2分别提高了15.6和9.3倍;突变株发酵液粗提物和组分11对E. faecium CCARM 5203,E. faecalis CCARM 5172和S. aureus CCARM 3090的抗菌活性与野生株相比明显提高,而且突变株丧失了产生孢子的能力。结论 wblAyo参与了S. youssoufiensis OUC6819的次级代谢和形态分化过程。wblAyo的阻断激活了S. youssoufiensis OUC6819中抗MDR菌活性次级代谢产物的产生,为继续挖掘活性化合物提供了必要基础,还为其他海洋链霉菌中隐性基因簇的激活提供了参考。     

海洋放线菌分离及菌株Streptomyces sp.LXF-80的次级代谢产物的研究

目的对黄海和渤海的海泥样品进行海洋放线菌分离,并选出1株次级代谢产物较丰富的菌株Streptomyces sp.LXF-80进行研究。方法采用稀释涂布平板法进行海洋放线菌的分离,应用溶剂萃取,TLC分析,柱色谱层析及制备HPLC等方法对菌株LXF-80的发酵产物进行研究,通过理化性质及波谱学手段并参阅文献进行化学结构鉴定,采用SRB法及MTT法评价化合物的抗肿瘤活性。结果从海泥样品中分离到海洋放线菌142株,从菌株LXF-80发酵提取物中分离到化合物5个,其中聚酮类化合物1个,环二肽类化合物4个,经结构鉴定分别为Enterocin(1)、Cyclo(L-Trp-L-Lue)(2)、Cyclo-...     

美替拉酮对放线菌Streptomyces sp. LXF-80代谢途径的影响

摘 要：目的 渤海海泥来源放线菌Streptomyces sp. LXF-80可以生产罕见的包含α－吡喃酮的三环骈合聚酮化合物肠道菌素（Enterocin）。美替拉酮是一种细胞色素P450氧化酶的抑制剂,本实验试图利用美替拉酮影响肠道菌素的生合成过程,表达获得新的聚酮类化合物。方法 向LXF-80的发酵培养基中添加酶抑制剂,结合HPLC分析确定最优条件,并进行大规模发酵和目标产物的分离。结果 从添加美替拉酮的LXF-80发酵提取物中共分离获得3个化合物,包括Enterocin（1）、5-deoxyenterocin（2）以及3-epi-5-deoxyenterocin（3）。结论 实验结果证明美替拉酮的添加,影响了菌株聚酮类化合物的生合成过程,得到两个肠道菌素的形成过程中的中间体化合物2和3。