铜绿假单胞菌褐藻胶合成抑制剂筛选模型的建立

目的 建立以铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）乙酰化褐藻胶的合成为靶向的筛选模型,用于筛选抑制铜绿假单胞菌褐藻胶合成的活性分子。方法 分别建立铜绿假单胞菌双层平板筛选模型和PalgD-GFP 荧光分子模型,从海洋微生物代谢产物中筛选抑制铜绿假单胞菌乙酰化褐藻胶合成的活性分子。 结果 利用2个筛选模型筛选300余种化合物,获得2种抑制铜绿假单胞菌合成褐藻胶的化合物,且化合物的抑制作用具有浓度依赖性,验证了模型的可行性和有效性。 结论 2种模型结合,可以高效、准确地筛选目标化合物,为解决细菌耐药问题提供了1种有效的手段。     

海洋细菌Thalassomonas sp. LD5中新型褐藻胶裂解酶TsAly7C的研究

目的对来源于Thalassomonas sp.LD5的褐藻胶裂解酶TsAly7C进行研究,以期获得具有优良性质的褐藻胶裂解酶,适应工业需求。方法在生物信息学分析的基础上,对TsAly7C进行了重组表达和酶学性质研究。结果通过生物信息学分析,TsAly7C属于PL7家族的第一亚家族。对重组TsAly7C(r TsAly7C)酶学性质进行分析,r TsAly7C的最适温度是30℃,最适p H为8.0(Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液),在底物中添加300 mmol/L NaCl时降解能力最强。r TsAly7C的p H稳定性和温度稳定性较好,在0～30℃保存1 h仍保有80%以上的酶活,是1种适低温性褐藻胶裂解酶。Cu²⁺、Co²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺和十二烷基硫酸钠(SDS)对r TsAly7C的酶活有明显的抑制作用。r TsAly7C是1种双功能褐藻胶裂解酶,以内切形式裂解褐藻胶产生不饱和二糖和单糖。     

辐射诱导的凋亡及其信号转导通路研究进展

随着核技术在工农业、医学、生命科学等方面应用的迅速发展,人们与放射线接触的机会日益增多,遭受辐射损伤的可能性随之增加。辐射作为贯穿性刺激因素,最先接触到的是细胞膜,可启动膜的信号传递;继之,射线通过胞质时,又影响位于胞浆内的信号转导分子,干预正常的胞内信号转导途径;当射线到达胞核时,直接损伤DNA分子,随后可活化多种蛋白质分子,激活相应的信号转导途径。本文拟对辐射所触发的细胞信号转导途径的研究进展作一综述。     

琼胶酶高产海洋假单胞菌CY24的筛选及培养条件优化

利用琼胶唯一碳源筛选法从海水中分离得到一株产琼胶酶假别单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)CY24,通过培养基组分的正交实验确定最适培养基配方为(w/v):NaCl 2.5％;干酪素0.25％;MgSO_4·7H_2O 0.5％;KCl 0.1％;FeSO_4·7H_2O 0.002％;CaCl_2 0.02％;NaH_2PO_4 0.06％;琼胶0.25％;pH7.0。最佳培养条件为25℃培养24h。经培养条件的优化后,粗酶液的酶活高达1.8U·mL~(-1),较优化前提高了20倍。为酶的大量生产和活性琼胶低聚糖的酶法制备创造了条件。     

海洋弧菌QY105中褐藻胶寡糖酶OalA的基因克隆、重组表达与性质研究?

目的 褐藻胶寡糖酶可将褐藻胶多糖和寡糖降解为单糖,但现有的褐藻胶寡糖酶数量极少且活力较差。本文旨在从海洋弧菌QY105中克隆寡糖酶OalA的编码基因,重组表达并研究其酶学性质。方法 利用简并PCR和SiteFinding-PCR从海洋弧菌QY105中克隆得到褐藻胶寡糖酶OalA的编码基因,在大肠杆菌中进行重组表达,对重组酶进行分离纯化及酶学性质研究。结果 褐藻胶寡糖酶OalA基因全长2082 bp,编码一条含有693个氨基酸残基的多肽链,理论分子量为79.17 kDa,理论等电点为4.98,属于多糖裂解酶第15家族（PL-15）。重组OalA比活力为9.2 U?mg?1,最适温度30 ℃,在10 ℃的酶活力达到最高酶活的45%,最适pH7.6,在低于30 ℃和pH6~10范围内稳定,偏好降解polyM。结论 OalA具有低温酶的特点,且对polyM具有偏好性,可用于褐藻胶单糖制备、PL-15家族结构与功能相互关系研究等领域。     

TRBP分子克隆及其功能初步研究

目的:构建TRBP原核表达载体,评价表达的重组TRBP蛋白对双链RNA的结合能力。方法:利用RT-PCR扩增小鼠TRBP基因双链RNA结合区,构建其与His标签融合的表达载体,转化E.coli BL21(DE3)菌株,利用Ni-NTA磁珠对重组蛋白进行分离纯化;体外转录合成小鼠肝脏miR-122前体RNA Pre-miR-122,分别利用PAGE电泳和等温量热滴定仪检测TRBP与Pre-miR-122的结合能力。结果:分离纯化得到的重组TRBP蛋白为可溶蛋白,Mr为32 400,结合在NI-NTA磁珠上的TRBP能有效的结合Pre-miR-122。结论:成功建立了TRBP原核表达系统,初步研究了TRBP重组蛋白与双链RNA的结合能力。     

κ-卡拉胶酶CgkX高效重组表达菌株的构建和发酵优化?

目的 CgkX是一种高活性、高稳定性的κ-卡拉胶酶,但产量低。本文旨在构建多种重组表达菌株,并进行发酵条件优化,以提高κ-卡拉胶酶CgkX的产量。方法 在分析了κ-卡拉胶酶CgkX基因序列中稀有密码子和氨基酸序列中含硫氨基酸的基础上,构建多种CgkX表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行重组表达和酶活测定,筛选其中最高效的表达菌株,并对发酵起始pH、诱导温度、IPTG浓度、装液量以及甘氨酸浓度等因素进行优化。结果 构建了4种重组表达载体,转入大肠杆菌BL21(DE3),发现E. coli BL21(DE3)/pET-22b-CgkX酶产量最高,是以前菌株的8倍。通过优化确定了最佳发酵条件为：发酵起始pH 7.5,IPTG浓度为0.05 mmol?L-1,诱导温度20 oC,装液量为75 mL,甘氨酸浓度为1 g?L-1。优化后酶产量达到32 U/mL,是优化前的7倍。结论 经过重组表达载体筛选和发酵优化,CgkX产量提高到最初的56倍,为酶解制备κ-卡拉胶寡糖提供了足量的工具酶。     

兔抗条纹斑竹鲨IgNAR多克隆抗体的制备和应用

目的 制备条纹斑竹鲨（Chiloscyllium plagiosum）IgNAR的多克隆抗体,为条纹斑竹鲨单域抗体的开发提供工具。方法 合成条纹斑竹鲨IgNAR恒定区的一段多肽作为抗原,免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体血清,采用间接ELISA法测定抗体的效价,并通过Western Blot检测多克隆抗体的特异性。此外,利用制备的多克隆抗体对条纹斑竹鲨外周血淋巴细胞进行免疫荧光和流式分析。结果 制备的抗血清效价高达1 000万,该多克隆抗体不仅能识别条纹斑竹鲨的IgNAR,还能识别护士鲨（Ginglymostoma cirratum）的IgNAR,但对条纹斑竹鲨的灵敏度更高。通过免疫荧光和流式细胞术确定了该多克隆抗体还可以识别条纹斑竹鲨外周血淋巴细胞跨膜型IgNAR。结论 成功制备了条纹斑竹鲨IgNAR的多克隆抗体,该抗体可用于Western Blot、免疫荧光和流式细胞术等实验,为条纹斑竹鲨单域抗体的开发提供了有力工具。     

活性氧信号转导作用靶标及作用机制

外界刺激在信号传递过程中产生活性氧(ROS),而ROS又可以刺激信号通路,参与细胞信号转导过程.在细胞凋亡信号转导的过程中,ROS既可以作为外界诱因,又是其他诱因在体内激发凋亡的一种中间产物,其机制可发生在凋亡过程的各环节,包括直接诱导凋亡或影响与凋亡有关的细胞内信号转导和基因表达.氧化还原调节可以发生于从受体到细胞信号通路的多水平环节,ROS可通过细胞膜靶标将刺激信号由细胞膜传至细胞内,作用于细胞内靶标激发信号级联反应,诱导细胞凋亡.本文就ROS信号转导通路的作用靶标及作用机制作一综述.     

甘糖酯对高脂血症大鼠主动脉中MCP-1表达的抑制作用甘糖酯对高脂血症大鼠主动脉中MCP-1表达的抑制作用

目的探讨甘糖酯对高脂血症大鼠主动脉中单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)表达的影响。方法以甘糖酯或甘糖酯辅以超氧化物歧化酶(SOD)抑制剂diethyldithiocarbamate(DDC)治疗高脂血症大鼠3周,测定SOD活性、脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的浓度变化及主动脉中MCP-1 mRNA的表达。结果甘糖酯治疗后MCP-1 mRNA的表达量显著降低,呈剂量依赖性关系;并升高SOD活性、降低MDA的含量;而在DDC作用下SOD活性被抑制,使MDA含量又升高,但是MCP-1 mRNA水平不受影响,仍处于降低状态。结论甘糖酯抑制高脂血症大鼠主动脉中MCP-1 mRNA的表达,且此抑制作用与其降低MDA的作用无关。