靶向幽门螺杆菌毒力因子HtrA鲨鱼纳米抗体的开发

目的 构建鲨鱼纳米抗体噬菌体展示文库,从中筛选出针对幽门螺杆菌关键毒力因子HtrA的鲨鱼纳米抗体。方法 用重组的HtrA蛋白免疫条纹斑竹鲨,从其外周血白细胞(PBLs)和脾脏组织中克隆鲨鱼纳米抗体（VNAR）的编码序列,构建鲨鱼纳米抗体噬菌体展示文库,并从中筛选出抗HtrA的鲨鱼纳米抗体。利用大肠杆菌表达系统对鲨鱼纳米抗体进行重组表达并纯化,并用ELISA检测了鲨鱼纳米抗体的亲和力和稳定性。结果 成功构建了针对HtrA的纳米抗体噬菌体展示文库,筛选出了两个鲨鱼纳米抗体(G11和1A5),分别在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中表达,纯化后进行进一步鉴定。评价了鲨鱼纳米抗体的亲和力和稳定性,G11和1A5的EC50值分别为21.2 nM和27.3 nM,并且在低pH溶液中表现出较高的稳定性。构建了1A5的双价鲨鱼纳米抗体,明显提高了抗原结合活性。     

兔抗条纹斑竹鲨IgNAR多克隆抗体的制备和应用

目的 制备条纹斑竹鲨（Chiloscyllium plagiosum）IgNAR的多克隆抗体,为条纹斑竹鲨单域抗体的开发提供工具。方法 合成条纹斑竹鲨IgNAR恒定区的一段多肽作为抗原,免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体血清,采用间接ELISA法测定抗体的效价,并通过Western Blot检测多克隆抗体的特异性。此外,利用制备的多克隆抗体对条纹斑竹鲨外周血淋巴细胞进行免疫荧光和流式分析。结果 制备的抗血清效价高达1 000万,该多克隆抗体不仅能识别条纹斑竹鲨的IgNAR,还能识别护士鲨（Ginglymostoma cirratum）的IgNAR,但对条纹斑竹鲨的灵敏度更高。通过免疫荧光和流式细胞术确定了该多克隆抗体还可以识别条纹斑竹鲨外周血淋巴细胞跨膜型IgNAR。结论 成功制备了条纹斑竹鲨IgNAR的多克隆抗体,该抗体可用于Western Blot、免疫荧光和流式细胞术等实验,为条纹斑竹鲨单域抗体的开发提供了有力工具。     

靶向幽门螺杆菌UreB鲨鱼纳米抗体的筛选与鉴定

目的 开发靶向幽门螺杆菌（H. pylori）尿素酶B亚基（UreB）的鲨鱼纳米抗体。方法 利用大肠杆菌表达系统对UreB进行重组表达,纯化后对条纹斑竹鲨进行免疫,通过间接ELISA检测免疫后鲨鱼血浆的抗体效价。提取鲨鱼外周血淋巴细胞及脾脏组织的总RNA,反转录成cDNA,PCR扩增鲨鱼纳米抗体片段,构建鲨鱼纳米抗体噬菌体展示文库。扩增噬菌体文库,采用固相淘选,通过噬菌体多克隆ELISA检测特异性噬菌体的富集程度。随后通过单克隆ELISA鉴定阳性噬菌体,并通过序列比对,确定靶向UreB的鲨鱼纳米抗体序列。构建鲨鱼纳米抗体重组表达质粒,利用大肠杆菌表达系统制备重组鲨鱼纳米抗体。通过ELISA检测鲨鱼纳米抗体对重组UreB和H. pylori菌株的结合能力。结果 成功制备了重组UreB蛋白,用于免疫鲨鱼,经6次免疫后构建了库容量为1.28×108 CFU的鲨鱼纳米抗体噬菌体展示文库。淘选到的两株靶向UreB的鲨鱼纳米抗体,具有较高的亲和力,其中1E3可特异性结合H. pylori。结论 成功筛选到靶向UreB鲨鱼纳米抗体,为H. pylori感染的诊断和治疗药物的开发奠定了基础。