人鼻咽癌CNE细胞摄取99mTcN(NOEt)2与99mTc-MIBI动力学对比研究

目的：研究^99mTc-氮二{（N-乙基-N-乙氧基二硫代氨基甲酸盐[N（NOEt）2]）和^99mTc甲氧基异丁基异腈（MIBI）在人鼻咽癌CNE细胞中的摄取动力学。方法：用放射性核素示踪技术研究人鼻咽癌CNE细胞在37℃和22℃时对^99mTcN（NOEt）2和^99mTc-MIBI的摄取动力学规律。结果：37℃和22℃时CNE细胞对^99mTcN（NOEt）2的摄取差异无统计学意义,^99mTcMIBI摄取则呈温度依赖性。37℃时CNE细胞对^99mTcN（NOEt）z摄取峰值为43．15％,^99mTc-MIBI为11．08％（P〈0．01）;5min时CNE细胞摄取^99mTcN（NOEt）2为峰值的63％．^99mTc-MIBI为48％（P〈0．05）;60min时^99mTcN（NOEt）2在CNE细胞中的滞留率为63．92％,^99mTc-MIBI为53．97％（P〈0．05）。结论：^99mTcN（NOEt）2可能较^99mTc-MIBI更适用于鼻咽癌显像,具有潜在的临床应用价值。     

活动性巨细胞病毒感染与反复自然流产的关系探讨

目的探讨活动性人巨细胞病毒（human cytomegalovirus,HCMV）感染与反复自然流产（recurrent spontaneous abortion,RSA）的关系.方法采集反复自然流产孕妇和正常产前体检孕妇外周血,分离外周血单个核细胞（PBMCs）和血浆,分别用免疫荧光法和实时定量PCR检测HCMV pp65抗原和HCMV DNA,并比较2种方法的一致性.结果 65例RSA患者HCMV pp65抗原有20例阳性,阳性率30.8%,50例正常体检孕妇 HCMV pp65抗原有4例阳性,阳性率8.0%,2组孕妇HCMV活动性感染率有显著性差异（χ^2=8.87,P＜0.01）.孕妇HCMV pp65抗原阳性率升高,孕妇流产几率增加（χ^2=7.53,P＜0.01）. 免疫荧光法和实时定量PCR有较好的一致性（92.3%）.结论反复自然流产孕妇 HCMV活动性感染率显著高于正常孕妇,HCMV pp65抗原检测也许可作为RSA早期诊断指标之一.     

白细胞介素18对病毒性心肌炎小鼠治疗作用的研究

近年来细胞因子在病毒性心肌炎 (ＶＭＣ)中的作用日益受到重视 ,而白细胞介素 1 8(ＩＬ 1 8)又称干扰素γ(ＩＦＮ γ)诱导因子 ,是新发现的一种多效型细胞因子 ,参与机体的多种炎症反应和免疫应答 ,且动物模型研究表明 ,ＩＬ 1 8具有抗病毒效应[1 ,2 ] 。为此 ,我们使用柯萨奇病毒Ｂ3ｍ(ＣＶＢ3ｍ) ,诱发小鼠急性ＶＭＣ后 ,投入基因重组的小鼠ＩＬ 1 8(ＩＬ 1 8)并观察其效应 ,以探讨ＩＬ 1 8对ＶＭＣ的治疗作用。材料和方法1 .病毒及实验动物 :ＣＶＢ3ｍ嗜心肌株 ,病毒原液效价为1 0 7ＴＣＩＤ50 ;Ｂａｌｂ/Ｃ小鼠 (由湖北省防疫站实验动物…     

鸟苷结合蛋白1对柯萨奇病毒B3及乙型肝炎病毒体外介导的不同作用

目的构建人鸟苷结合蛋白1（hGBP-1）真核表达质粒，观察hGBP-1体外对柯萨奇病毒B3（CVB3）和乙型肝炎病毒（HBV）的抑制作用。方法长链RT-PCR扩增全长hGBP-1编码区基因，克隆到pCR2．1TA克隆载体，再亚克隆到pcDNA3．1（-）真核表达载体。体外转染HepG2细胞和Hela细胞，Western blot检测hGBP-1的表达。然后分别观察转染细胞中hGBP-1对HBV体外复制子pHBV1．3和CVB3的抑制作用。ELISA检测共转染HepG2细胞培养L清HBsAg、HBeAg水平；Southern blot检测细胞HBVDNA复制中间体。TCID50试验检测Hela细胞培养物中CVB3感染量。结果成功构建hGBP-1真核表达质粒，能在HepG2细胞和HeLa细胞进行高效表达。该质粒与pHBV1．3共转染HepG2细胞，不能抑制HBV复制，HBsAg、HBeAg及HBV DNA复制中间体水平与对照相比都无明显变化。转染质粒在HeLa细胞上对CVB3复制有明显的抑制作用，CVB3感染量显著降低，尤其在低剂量病毒攻击时能完全抑制CVB3复制。结论hGBP-1可能在IFN介导的抗CVB3中起重要作用，但不能抑制HBV的复制。     

特发性右室心律失常患者血清CMV、CVB病毒抗体分析及其临床意义探讨

目的：通过检测病毒血清抗体,探讨相关病毒感染与特发性右室心律失常（IRVA）发生的相关性.方法：病例对照研究分为3组：IRVA组、其他心脏病平行对照组（Heart-Disease-Control）和健康对照组（Healthy-Control）,每组30例,性别年龄匹配.接受常规检查后进行血清学检查,随访6～12个月.结果：IRVA组与其他2组的X线心胸比值、超声心脏测值比较,无显著性差异（P＞0.05）.3组的柯萨奇B组病毒（CVB）血清IgM阳性率组间差异无显著性;而IRVA组的巨细胞病毒（CMV）血清IgM阳性率（73.3%）显著高于其他2组（P＜0.01）,随访6～12个月后,该组CMV IgM阳性率仍然持续增高（66.7%）.相关性分析发现,CVB感染与IRVA发生的联系强度低（P＞0.05）,而CMV感染与IRVA发生的联系强度高（P＜0.001）.4种常见的病毒血清抗心肌自身抗体检测中发现IRVA组抗β1受体抗体阳性率（60.0%）显著高于其他2组（P＜0.01）.结论：IRVA患者血清CMV IgM阳性率高,该抗体的出现与IRVA的发生高度相关;CMV感染引起IRVA的发生可能与免疫机制（抗β1受体抗体介导）有关.     

一种新的土拨鼠α干扰素基因分型方法的建立及其意义

目的：建立新的土拨鼠α干扰素（IFN-α）基因分型方法，分析急性和慢性土拨鼠肝炎病毒（Woodchuck hepati-tis virus，WHV）感染的土拨鼠肝细胞中不同型别的IFN-α基因表达谱及其意义。方法：利用已知序列和基因型的土拨鼠IFN-α基因克隆质粒，建立基于土拨鼠IFN-α基因序列的限制性片段长度多态性的土拨鼠IFN-α基因分型方法。PolyIC体外刺激正常土拨鼠外周血单个核细胞（PBMC），调查正常土拨鼠PBMC受PolyIC刺激后IFN-α基因的表达谱。提取急性和慢性土拨鼠肝炎病毒感染的土拨鼠肝组织mRNA，RT-PCR扩增土拨鼠IFN-α基因，分子克隆后调查急性和慢性感染的土拨鼠肝细胞中IFN-α基因表达谱。结果：建立了土拨鼠IFN-α基因限制性片段长度多态性分型方法。急性和慢性感染的土拨鼠肝细胞中IFN-α基因的表达谱明显不同于正常动物的表达谱，假基因表达所占比例大。结论：新建立的土拨鼠IFN-α基因分型方法可用于分析土拨鼠不同组织中IFN-α的基因表达谱。     

稳定高表达Uroplakin Ⅱ基因人膀胱癌细胞株的建立及其意义

目的　建立稳定高表达UroplakinII(UPII)基因的人膀胱癌细胞株。方法　采用分子克隆技术构建含全长UPII结构基因的真核表达载体 ,进行酶切鉴定、核酸序列分析 ,并将其在阳离子脂质体Lipofectamine 2 0 0 0的介导下转染UPII基因缺陷型膀胱移行细胞癌 (TCC)细胞株EJ ,经G418筛选获得抗性亚克隆细胞株 ;逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)、Westernblotting方法对亚克隆细胞株进行UPII基因表达鉴定。结果　所获UPII基因真核表达载体pcDNA3 UPII转染EJ细胞后 ,通过G418持续压力筛选 4周获得亚克隆细胞株EJ/UPII ;RT PCR、Westernblotting均未检测到EJ细胞的UPII基因表达 ,而EJ/UPII细胞中UPIImRNA和蛋白表达水平显著增高 (P <0 .0 1)。结论　通过基因转染方法建立了稳定高表达UPII基因的膀胱TCC细胞株 ,为进一步探讨UPII基因在膀胱TCC生物学行为中的作用及其靶向生物治疗策略奠定了基础。     

靶向人肝素酶短发卡状RNA表达载体的构建及其沉默作用

目的 构建靶向人肝素酶(HPSE)的短发卡状RNA(shRNA)表达载体,探讨其基因沉默作用.方法 根据人肝素酶mRNA序列设计shRNA,合成两条互补的寡核苷酸链,退火后连接入pGenesil-1载体,转化扩增后进行测序鉴定;重组质粒在阳离子脂质体Lipofectamine 2000的介导下,瞬时转染人胃癌细胞株SGC-7901、人前列腺癌细胞株PC-3、人膀胱癌细胞株EJ,每种细胞分别设空白对照组、空载体pGenesil-Negative转染组、pGenesil-HPSE shRNA转染组3组,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot法检测各种细胞中肝素酶基因表达水平,黏附实验和transwell小室实验检测癌细胞游走、侵袭能力.结果 所构建的shRNA载体插入基因片段与设计序列完全匹配,载体构建成功;重组质粒转染SGC-7901、PC-3、EJ细胞后,肝素酶mRNA表达分别下调78.6%(P<0.01)、82.6%(P<0.01)、81.9%(P<0.01),肝素酶蛋白表达分别下调76.4%(P<0.01)、85.9%(P<0.01)、83.3%(P<0.01),细胞黏附能力分别下降37.7%(P<0.01)、44.6%(P<0.01)、43.8%(P<0.01),细胞侵袭能力分别下降66.8%(P<0.01)、76.6%(P<0.01)、80.5%(P<0.01).结论 成功构建了靶向人肝素酶的shRNA表达载体,沉默肝素酶基因表达后,能抑制多种癌细胞的游走和侵袭能力.     

通用表达型T载体的构建与真核基因的快速克隆表达

目的:为简化PCR产物真核表达载体构建步骤,构建真核表达型T载体,并对其特性及表达效率进行分析.方法:限制性内切酶EcoR V酶切真核表达载体pcDNA3,回收线性化质粒片段与dTTP 70℃退火,构成T克隆载体并回收纯化.将增强绿色荧光蛋白基因(EGFP)和中国旱獭a干扰素基因(cwIFNA5)分别扩增后直接克隆到新构建的表达型T载体,转化感受态细菌,挑选阳性菌并制备质粒瞬时转染真核细胞,荧光显微镜观察EGFP的表达,病毒保护试验检测中国旱獭a干扰素的生物学活性.结果:外源基因EGFP和cwIFNA5克隆进该载体后可以进行高效表达,基因转染72 h后,荧光显微镜观察到EGFP基因转染细胞荧光阳性率在80%以上,荧光强度高:病毒保护试验表明cwIFNA5转染细胞培养上清干扰素效价高达1∶600.结论:本研究构建的表达型T载体可用于基因的克隆之外,还可以直接用于基因的高效表达作蛋白质功能分析.