miR-148b/DUSP1调节巨噬细胞分泌细胞因子CD206促进肝癌的发生

目的 探讨miR-148b/DUSP1信号通路调节巨噬细胞分泌细胞因子CD206的表达对肝癌发生的影响.方法 利用全自动磁珠提取纯化系统提取外周血单核细胞并培养,用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)和巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor,M-CSF)分别诱导生成M1型和M2型巨噬细胞,CD68、CD206进行表型鉴定,ELISA检测M1和M2型巨噬细胞分泌的细胞因子CD206的表达,CCK-8和Transwell实验检测巨噬细胞分泌细胞因子CD206对肝癌细胞(HepG2和Huh7细胞)增殖、侵袭、转移的影响,双荧光素酶报告基因系统验证miR-148b与DUSP1的靶向结合.结果 初步分离并鉴定M1和M2型巨噬细胞,M2型巨噬细胞分泌的细胞因子CD206促进肝癌细胞的生长和侵袭、转移,双荧光素酶报告基因证实DUSP1为miR-148b的靶基因,miR-148b/DUSP1信号通路促进肝癌的发生、发展,巨噬细胞标志物与肝癌患者的临床病理特征相关.结论 miR-148b/DUSP1信号通路影响巨噬细胞分泌的细胞因子促进肝癌发生、发展.     

PAMAM/sh-miR-34a纳米复合物对黑素瘤细胞的抑制作用

目的 将树枝状聚合物聚酰胺-胺(PAMAM)包载可以表达具有抑制人恶性黑素瘤细胞A375增殖、侵袭和转移的miR-34a的质粒sh-miR-34a,构建聚阳离子纳米复合物PAMAM/sh-miR-34a.考察形成的复合物的粒径、zeta电位、细胞摄取,以及对A375细胞的抑制作用.方法 利用粒度测定仪测定纳米复合物的粒径和电位,凝胶电泳实验测定PAMAM对sh-miR-34a的包裹能力;利用罗丹明标记的sh-miR-34a考察A375细胞对纳米复合物的摄取;CCK8法测定PAMAM/sh-miR-34a对A375细胞的抑制作用;Transwell法测定PAMAM/sh-miR-34a抑制A375细胞迁移和侵袭作用;蛋白质印迹法测定PAMAM/sh-miR-34a对A375细胞中pAkt、pRb、pERK1/2蛋白表达的阻滞作用.结果 PAMAM包裹sh-miR-34a可形成稳定的纳米复合物,在N/P=20时,细胞对PAMAM/sh-miR-34a的摄取达最高(P＜0.05).PAMAM可以有效携带sh-miR-34a进入A375细胞,体外抑制A375细胞的增殖、侵袭和迁移,并且可以阻滞A375细胞中pAkt、pRb和pERK1/2蛋白的表达.结论 PAMAM可以包裹sh-miR-34a并对人恶性黑素瘤A375细胞起到抑制作用.     

MiR-148a调控胃癌细胞侵袭迁移的作用机制研究

目的 研究miR-148a在胃癌侵袭迁移中的作用,为新肿瘤标志物的研究提供理论基础。方法 荧光实时定量PCR（RT-PCR）检测miR-148a在胃癌细胞系和正常胃黏膜细胞中的表达水平,HGC-27分别转染miR-148a control/miR-148a mimic和miR-148a control/miR-148a inhibitor后检测miR-148a表达水平的改变,Transwell法检测miR-148a对HGC-27细胞侵袭和迁移的影响,Western blot法检测miR-148a对胃癌细胞中c-myc蛋白表达的调控。结果 MiR-148a在胃癌细胞中的表达明显低于正常胃黏膜细胞;HGC-27转染miR-148a mimic后miR-148a表达升高,HGC-27转染miR-148a inhibitor后miR-148a表达下降;miR-148a能够显著抑制HGC-27细胞的侵袭和迁移;miR-148a能够明显下调c-myc蛋白的表达。结论 miR-148a通过c-myc来发挥抑制胃癌侵袭迁移的作用。     

miR-203a-3p通过ALOX15途径抑制胃癌细胞铁死亡

目的探讨miR-299-3p靶向调控OCT4B1对结直肠癌细胞SW480增殖、迁移、侵袭及凋亡的作用。 方法将SW480细胞分为NC组、mimics组、inhibitor组,采用MTT法检测细胞活力,结晶紫染色检测单克隆形成数,流式细胞术检测细胞凋亡,Transwell实验检测细胞侵袭能力,qRT-PCR测定细胞miR-299-3p和OCT4B1 mRNA,蛋白免疫印迹法测定OCT4B1蛋白表达。荧光素酶报告基因检测miR-556-3p对SW480细胞OCT4B1活性的调控作用。 结果与NC组比较,miR-299-3p水平、细胞凋亡率mimics组升高,inhibitor组降低,且mimics组高于inhibitor组(P＜0.05);OCT4B1 mRNA和蛋白水平、细胞穿膜数、细胞存活率、单克隆形成数mimics组降低,inhibitor组升高,且mimics组低于inhibitor组(P＜0.05)。 结论miR-299-3p过表达可抑制结直肠癌细胞SW480增殖、迁移、侵袭,促进其凋亡,可能与miR-299-3p抑制OCT4B1 mRNA和蛋白表达有关。     

miR-875-5p通过靶向USF2抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭

目的:探讨miR-875-5p对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其机制。方法:采用qPCR法检测胃癌细胞BGC-823、HGC-27、MGC-803、SGC-7901、AGS、MKN-45和胃黏膜上皮细胞GES-1中miR-875-5p的表达水平。利用脂质体转染技术,分别将miR-875-5p模拟物/抑制剂(mimic/inhibitor)及其阴性对照质粒(miR-NC/Anti-miR-NC)转染至AGS细胞/MKN-45细胞,构建过表达/抑制miR-875-5p的细胞模型,空白对照组(Control组)不转染。通过CCK-8、克隆形成、Transwell等实验分别检测miR-875-5p表达变化对细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭的影响。采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-875-5p与上游刺激因子2(USF2)的靶向关系,WB实验验证miR-875-5p对USF2的调控作用并检测USF2蛋白的表达。构建MKN-45细胞裸鼠移植瘤模型,验证miR-875-5p过表达对MKN-45细胞成瘤能力的影响。结果:miR-875-5p在6种胃癌细胞中表达水平显著低于胃黏膜上皮细胞GES-1(均P<0.01)。与Control组和miR-NC组相比,miR-875-5p mimic组AGS细胞的增殖、克隆形成率、迁移和侵袭细胞数,以及USF2蛋白的表达均显著降低(P<0.05或P<0.01);miR-875-5p inhibitor组MKN-45细胞的增殖、克隆形成率、迁移和侵袭细胞数,以及USF2蛋白的表达均显著提高(P<0.05或P<0.01)。双荧光素酶报告基因实验证明,miR-875-5p能够直接靶向USF2基因。体内成瘤实验结果表明,过表达miR-875-5p显著抑制MKN-45细胞移植瘤的生长(均P<0.01)。结论:miR-875-5p通过靶向USF2抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭。     

miR-885-3p靶向AKT1对结直肠癌细胞HT-29放射敏感性的影响

目的 探究miR-885-3p对结直肠癌细胞HT-29放射敏感性的影响以及作用机制。方法 荧光定量PCR检测经不同剂量(0、2、4、6、8 Gy)X射线照射后HT-29细胞中miR-885-3p的表达量;建立过表达miR-885-3p细胞株,功能试验探讨其对HT-29细胞放射敏感性的影响;生物信息学预测miR-885-3p下游调控的靶基因,双荧光素酶报告基因法进一步验证;上调和下调miR-885-3p表达量探讨miR-885-3p与靶基因丝苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)表达量的调控关系;慢病毒转染敲减AKT1表达量,观察其对HT-29细胞放射敏感性的影响;共转染miR-885-3p模拟物,探讨过表达AKT1对miR-885-3p诱导的HT-29细胞放射敏感性的影响。结果 miR-885-3p在放射诱导的HT-29细胞中表达上调(F=46.64,P<0.05);过表达miR-885-3p和敲减AKT1可通过抑制HT-29细胞存活、促进其凋亡,从而增强HT-29细胞放射敏感性(t=12.33、12.95,P<0.05),放射增敏比(SER)分别为1.602和1.946;抑制miR-885-3p可通过促进HT-29细胞存活、抑制其凋亡从而促进HT-29细胞放射抵抗(t=11.94,P<0.05),SER为0.839;AKT1是miR-885-3p下游靶基因;过表达AKT1反转miR-885-3p增强HT-29放射敏感性的作用,SER为0.680。结论 miR-885-3p通过直接靶向AKT1增加结直肠癌HT-29细胞放射敏感性,为提高临床结直肠癌放疗敏感性提供一个靶点。     

苦木碱F通过miR-331-3p调控宫颈癌HeLa细胞增殖及凋亡的机制研究

目的:探讨苦木碱F调控miR-331-3p在宫颈癌HeLa细胞增殖及凋亡中的作用及机制。方法:MTT法检测苦木碱F对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响; 流式细胞术检测苦木碱F对宫颈癌HeLa细胞凋亡的影响; RT-qPCR检测苦木碱F处理HeLa细胞后miR-331-3p的表达; miR-331-3p mimic或miR-331-3p inhibitor 转染HeLa细胞,经苦木碱F处理后检测HeLa细胞的增殖及凋亡情况; 使用生物信息学和双荧光素酶报告基因实验预测及验证miR-331-3p与蛋白酶体活化复合物3(PSME3)的靶向关系; Western blot检测HeLa细胞中凋亡相关蛋白表达情况。结果:苦木碱F能显著抑制HeLa细胞增殖,促进凋亡,且具有浓度依赖性(P<0.01); 苦木碱F显著上调HeLa细胞中miR-331-3p的表达(P<0.01); miR-331-3p mimic能显著抑制HeLa细胞增殖能力,促进细胞凋亡; miR-331-3p inhibitor能显著降低苦木碱F对HeLa细胞增殖的抑制以及凋亡的促进作用(P<0.05); 生物信息学预测PSME3是miR-331-3p的靶基因之一,双荧光素酶报告基因结果显示miR-331-3p与PSME3 3'UTR靶向结合; 与苦木碱F+NC inhibitor +NC-siRNA组比较,苦木碱F+miR-331-3p inhibitor +NC-siRNA组中细胞存活率升高,细胞凋亡率降低,β-catenin和Bcl-2蛋白水平升高,Bax蛋白水平降低,而敲低PSME3能逆转这一结果,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:苦木碱F通过介导miR-331-3p/PSME3轴抑制宫颈癌HeLa细胞增殖,促进凋亡,发挥抗肿瘤作用。     

特应性皮炎患者外周血调节性T细胞及皮损中miR-31、Foxp3的表达

目的 探讨特应性皮炎（AD） 患者外周血调节性T细胞（Treg 细胞）及皮损组织中miR-31、Foxp3的表达水平及其相关性。方法 用流式细胞仪检测37例AD患者外周血Treg细胞的比例,实时荧光定量RT-PCR检测miR-31及Treg细胞特异性转录因子Foxp3 mRNA的表达水平;并以33例性别、年龄匹配的健康儿童做对照。检测5例急性期AD患者皮损与皮损周围组织中miR-31及Foxp3 mRNA的表达水平,并以5例健康人皮肤组织标本为对照。采用独立样本t检验、单因素方差分析和线性相关进行统计学分析。结果 AD患者外周血Treg细胞比例明显低于健康对照组（2.12% ± 0.60%比4.99% ± 1.27%,P < 0.01）;miR-31 mRNA表达水平明显高于健康对照组（6.01 ± 1.76比1.62 ± 0.51,P < 0.01）;Foxp3 mRNA表达水平显著低于健康对照组（0.78 ± 0.17比1.87 ± 0.71,P < 0.01）。AD患者皮损、皮损周围组织及健康人皮肤组织中miR-31及Foxp3 mRNA表达水平间差异均有统计学意义。miR-31表达水平：皮损 > 皮损周围组织 > 健康人皮肤组织,F = 54.501,P < 0.01;Foxp3表达水平：皮损 < 皮损周围组织 < 健康人皮肤组织,F = 37.837,P < 0.01。AD患者外周血miR-31 mRNA表达水平与疾病严重程度评分呈正相关（r = 0.417,P = 0.010）,与Treg细胞比例（r = -0.404,P = 0.013）及Foxp3 mRNA表达水平呈负相关（r = -0.409,P = 0.012）;皮损及皮损周围组织中miR-31 mRNA表达水平与Foxp3 mRNA表达水平呈负相关（r = -0.392,P = 0.032）。结论 AD患者miR-31高表达及Foxp3低表达可能与AD的发病相关。 【关键词】 皮炎,特应性; miR-31; T淋巴细胞,调节性; Foxp3     

miR-564在关节软骨损伤修复中作用机制的研究进展

关节软骨损伤修复一直是关节外科的热点和难点,最新研究表明,miR-564可能在关节软骨损伤修复中起着至关重要的作用。miR-564是位于第3号染色体上的非编码RNA,其功能主要是通过影响mRNA的稳定性和翻译进而参与基因表达的转录后调节,因此未来有望通过调控miR-564实现关节软骨损伤的原位修复。本文就miR-564的结构、功能及在关节软骨损伤修复中的作用机制作一综述。     

TLR2下游辐射防护关键miRNA筛选及miR-21功能验证

目的 筛选Toll样受体2（Toll-like receptor 2, TLR2）通路下游与辐射防护调控相关的关键miRNA,并探讨miR-21功能。方法 以⁶⁰Co γ射线对野生型（wild type, WT）、TLR2 KO小鼠分别进行6.0、7.0、8.0 Gy全身照射,观察小鼠生存情况;通过转录组测序筛选骨髓细胞内TLR2通路下游关键miRNA,并通过QT-PCR验证其表达。过表达/敲低该miRNA后检测其生物学功能。结果 6.0、7.0、8.0 Gy全身照射后,TLR2 KO小鼠较WT小鼠辐射敏感性增加（χ²=4.490、13.100、7.928,P<0.05）,骨髓移植实验证明TLR2 KO小鼠辐射敏感性增加与照射后骨髓细胞损伤有关（χ²=4.291,P<0.05）。转录组测序筛选到差异基因55个（[log2 Fold Change]>0.95,Q<0.05）,其中上调基因28个,下调基因27个;定量PCR实验确定TLR2 KO（t=9.420,P<0.01）与MyD88 KO（t=10.700,P<0.01）小鼠骨髓细胞内miR-21表达下调。PAM3CSK4刺激后小鼠骨髓细胞内白介素6（IL-6）（t=13.790,P<0.05）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）（t=14.280,P<0.05）表达量上调且依赖于TLR2。miR-21过表达可以促进EL4（t=5.951,P<0.05）和NIH/3T3（t=4.786,P<0.05）辐射后细胞活力,抑制WT小鼠（t=4.842,P<0.05）和TLR2 KO小鼠（t=10.520,P<0.05）BMCs辐射后细胞凋亡。miR-21敲低后降低EL4（t=4.815,P<0.05）和NIH/3T3（t=4.042,P<0.05）辐射后细胞活力。结论 miR-21在TLR2辐射防护进程中具有关键调控作用,其作用机制可能与上调IL-6与TNF-α有关。