阴道毛滴虫病毒衣壳蛋白基因cap2037的克隆与表达

目的对阴道毛滴虫病毒衣壳蛋白基因的克隆与原核表达。方法提取阴道毛滴虫总核酸为模板，根据所克隆的阴道毛滴虫病毒部分序列和GenBank中发表的阴道毛滴虫病毒TvV—T1序列设计一对引物，经RT—PCR得到与预计大小一致的PCR特异性产物，将其克隆到pMD-18T载体后测序，并与GenBank中核苷酸序列进行同源性搜索与分析，再将其克隆至表达载体pET28a。并以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。结果目的基因片段长度为2037bp，与阴道毛滴虫病毒T1株（U08999）的同源性最高为82．9％，构建原核表达载体pET—Cap2037；IPTG诱导后，SDS—PAGE显示表达产物的大小约75kDa。结论成功克隆出阴道毛滴虫病毒衣壳蛋白基因序列，与TVV—T1株序列有82．9％的同源性，经IPTG诱导，SDS-PAGE分析表明，75kDa蛋白基因在大肠杆菌BL21（DE3）中得到高效表达。     

AUF1 is upregulated by angiotensin II to destabilize cardiac Kv4.3 channel mRNA

Expression of cardiac myocyte Kv4 channels (Kv4.3 for human, Kv4.2 and Kv4.3 for rodents) is downregulated with hypertrophy in vivo leading to a decrease in the transient outward current (Ito). This effect is recapitulated in vitro with rat neonatal cardiac myocytes treated with angiotensin II (Ang II), which acts via AT₁ receptors, NADPH oxidase and p38 MAP kinase to destabilize the 3′ untranslated region (3′UTR) of the Kv4.3 channel messenger RNA (mRNA). Here deletion analysis and mutagenesis identify an AU-rich element (ARE) in the Kv4.3 3′UTR that is required for Ang II-induced destabilization. Overexpression of AUF1 (ARE/poly-(U)-binding/degradation factor 1), an RNA destabilizing protein, mimics and occludes the Ang II effect, while RNA interference targeted against AUF1 blocks the Ang II effect on the Kv4.3 3′UTR. Ang II upregulates AUF1 by activating AT₁ receptors, NADPH oxidase and p38 MAP kinase. Finally, pull-down assays establish that Ang II increases AUF1 binding to the ARE required for destabilization, while binding of the mRNA stabilizing protein HuR is unaffected. Hence, Ang II acts via AT₁ receptors, NADPH oxidase and p38 MAP kinase to upregulate AUF1, which in turn binds to an ARE in the Kv4.3 3′UTR to destabilize the channel mRNA.     

弓形虫致密颗粒蛋白GRA2真核表达质粒的构建与体外表达

目的构建弓形虫致密颗粒蛋白GRA2的真核表达重组质粒。方法设计合成GRA2引物，运用PCR方法扩增其基因片段，经克隆至pMDl8-T载体后，亚克隆至真核表达质粒pcDNA3．1（-）而构建重组表达质粒pcDNA3．1-GRA2。脂质体法将构建的重组质粒转染HFF细胞，RT—PCR法检测转染细胞中GRA2的表达情况。结果PCR扩增GRA2基因序列正确，构建的重组表达质粒pcDNA3．1-GRA2经PCR、EcoRⅠ／HindⅢ双酶切和测序鉴定正确；转染GRA2基因的细胞，RT—PCR可见目的条带。结论成功获得真核表达重组质粒pcDNA3．1-GRA2，为进一步研究弓形虫疫苗的免疫保护性奠定基础。     

内毒素血症时肝窦内皮细胞脂多糖受体CD14蛋白表达的观察

目的观察内毒素血症时肝窦内皮细胞(LSECs)中CD14蛋白合成和CD14 基因的表达,以及CD14蛋白在内毒素介导LSECs激活中的作用. 方法经尾静脉注入脂多糖(LPS,E coli O111B4)5mg/kg,建立大鼠内毒素血症动物模型,分别于术后0(对照组)、3、6、12、24h活杀取材.用兔抗鼠CD14抗体和异硫氢酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔IgG对LSECs进行孵育后,流式细胞仪测定LSECs的平均荧光强度(MFI)及FITC阳性细胞数;用原位杂交法测定LSEC中CD14 mRNA的表达.用原位胶原酶灌注法分离大鼠LSECs,用不同浓度LPS(0、0.01、1、10、100μg/ml)刺激LSECs.并用CD14抗体阻断LSECs的 CD14蛋白后,再用不同浓度LPS(0、0.01、1、10、100μg/ml)刺激LSECs.测定LPS介导LSECs肿瘤坏死因子(TNF)-α及白细胞介素-6(IL-6)分泌及CD14抗体对LSECs细胞因子分泌的影响. 结果内毒素血症大鼠3、6、12和24h 时LSECs的MFI明显增加;FITC阳性细胞数也明显增多,分别为54.32%、65.83%、85.61%和45.65%,与对照组的4.45%比较差异有非常显著意义(P＜0.01).原位杂交显示,内毒素血症大鼠LSECs中CD14 mRNA的表达明显增强,而对照组CD14 mRMA无阳性表达.LPS组TNF-α的含量(pg/ml)分别为54.49±6.02、84.65±10.16、206.54±23.55、349.87±39.47和365.76±40.31;CD14阻断组TNF-α的含量(pg/ml)分别为55.93±6.95、63.32±7.81、85.34±9.72、112.75±13.54、198.66±21.54;两组间比较差异有非常显著意义(P＜0.01).LPS组IL-6的含量(pg/ml)分别为103.34±12.52、187.39±20.31、243.87±27.83、289.51±30.15、298.53±31.94;CD14阻断组IL-6的含量(pg/ml)分别为104.37±11.49、125.02±13.58、164.59±19.47、183.47±20.17、221.76±26.43;两组间比较差异有非常显著意义(P＜0.01). 结论内毒素血症时LSECs能合成CD14蛋白及表达CD14基因;抗CD14抗体对LPS诱导LSECs TNF-α和IL-6的分泌有抑制作用;CD14蛋白的表达在内毒素介导LSECs激活中可能起重要作用.     

大肠肿瘤细胞凋亡及相关基因表达的研究

为了探讨Ｂｃｌ－２和Ｐ５３蛋白在大肠肿瘤中的表达及与细胞凋亡的关系，用免疫组化方法观察了４５例大肠腺瘤和６１例大肠癌中Ｂｃｌ－２和Ｐ５３蛋白的表达。正常大肠粘膜中Ｂｃｌ－２和Ｐ５３均未见表达，而大肠腺瘤及大肠癌阳性率均较正常明显增加（Ｐ〈０．０１）。大肠腺瘤Ｐ５３表达随腺瘤大小增加而增加，其中≥２０ｍｍ组阳性率（７７．７８％）显著高于〈１０ｍｍ组（３５．００％，Ｐ〈０．０５）。Ｐ５３蛋白阳性率也随