pGenesil-siHBV X 对 HepG2.2.15 细胞 HBV 表达和复制的抑制效果研究

 目的 研究针对HBV X基因区设计的小干扰RNA（siRNA）表达载体质粒pGenesil-siHBV X 对HepG2.2.15细胞HBV表达和复制的抑制效果及特异性。方法 针对HBV X区设计siRNA表达载体质粒pGenesil- siHBV X。分别用培养液（空白对照）、脂质体Metafectene、pGenesil 空载体、pGenesil-siHK（阴性对照）、pGenesil-siAFP（特异性对照）、pGenesil-siHBV X处理或转染HepG2.2.15细胞各3次。于每次转染后24 h，取各组细胞培养上清液，用时间分辨荧光免疫测定技术检测上清液中HBsAg和HBeAg含量，用化学发光法检测AFP含量，用PCR荧光定量技术检测HBV-DNA复制水平。 结果 pGenesil-siHBV X转染能抑制HepG2.2.15细胞对HBV标志物的表达，且抑制作用随转染次数增加而增强。第3次转染后，pGenesil-siHBV X组细胞上清液中 HBsAg、 HBeAg和HBV-DNA检测结果分别为（6.26 ± 1.07）ng/ml 、（0.13 ± 0.05）Ncu/ml和（3.01 ± 0.40）×107拷贝/ml，与空白对照组的（22.50 ± 1.39）ng/ml、（1.12 ± 0.11）Ncu/ml和（12.33 ± 1.28）×107拷贝/ml比较，差异有统计学意义（t值分别为12.80、12.21、9.71，P < 0.05）；pGenesil-siHBV X 转染不影响细胞对AFP的表达（t = 0.18，P = 0.86）。结论 pGenesil-siHBV X可以有效和特异地抑制HepG 2.2. 15细胞HBV-DNA的复制及HBsAg和HBeAg表达。     

细胞色素P450 1A1cDNA表达质粒的构建及转基因细胞系的建立

将ＣｙｔＰ４５０１Ａ１ｃＤＮＡ片段亚克隆至哺乳动物细胞高表达型穿梭载体中，酶切图谱显示片段被正向克隆于多克隆位点中。运用电穿孔法将重组质粒转入人羊膜ＦＬ细胞中国仓鼠ＣＨＬ及Ｖ７９细胞中，经Ｇ４１８筛选３周后获得抗性细胞克隆，并扩大成系。     

运用变性高效液相色谱对肺炎克雷伯菌产ESBL进行基因分型

目的 通过运用变性高效液相色谱（DHPLC）技术对前期研究已确认产超广谱β-内酰胺酶（ESBL）的肺炎克雷伯菌临床分离株TEM型质粒进行基因分型,试图建立一种方便快捷的用于ESBL分子诊断及其流行病学监测的新方法.方法 利用PCR技术从肺炎克雷伯菌临床分离株中扩增出TEM型质粒的编码序列,扩增产物运用DHPLC技术进行分析,分析提示,异常的样本通过测序确定其基因突变的类型,最后通过比对确定其基因型.结果 共分析了101例肺炎克雷伯菌临床分离株,全部样本均扩增出TEM型质粒的编码序列,经过DHPLC分析,52例（51.4%）样本表现为单一的洗脱峰,其形态与TEM-1标准菌株的峰型相一致,测序确定它们的碱基序列亦相一致,不存在变异,为TEM-1型;49例（48.6%）样本表现为异常的洗脱峰,它们均为双峰,形态一致,但异源双链峰的高度有差异,测序结果表明它们均存在四种相同的基因突变,在NCBI网站比对后确定为TEM-116;测序结果还提示,部分样本中TEM-1和TEM-116混合存在,其比例的不同表现为DHPLC时异源双链峰高度的差异;文献检索表明,本次确定的TEM-116为一新的基因亚型,为国内首次报道.结论 DHPLC具有简便快捷、高通量和自动化的特点,重复性好,不仅可对已知突变作出即时诊断,还可发现新的基因亚型,不失为一种较好的ESBL分子诊断方法及其流行病学监测手段.     

质粒pRSVTH的重组和在体外培养骨骼肌内的表达

用新生的ＳＤ大鼠骨骼肌进行原代培养，采用阳离子脂质体介导的方法，分别用含报告基团β－半乳糖苷酶基因的质粒ｐＲＳＶ－ＬａｃＺ和新重组的酪氨酸羟化酶基因的质粒ｐＲＳＶＴＨ转染上述培养细胞上。结果表明，所培养的骨骼肌细胞能在阳离子脂质体介导下被转入外源性基因，用组织化学和免疫组织化学方法检测证明其能表达外源性基因。     

华南地区质粒介导超广谱β-内酰胺酶的基因分型研究

目的：了解华南地区质粒介导超广谱β－内酰胺酶（ESBLs）的发生率及基因型特征。方法：收集2001年4月－9月革兰阴性菌临床分离无重复株共1184株，采用NCCLS表型筛选和确认试验进行了ESBLs产酶的识别，E-test法检测各亚型ESBLs的MICs值，质粒接合及电转化实验，耐药质粒提取及酶切指纹分析，等电聚焦电泳，PCR通用引物扩增TEM、SHV、CTX－M、VEB、PER、SFO基因及其克隆测序进行ESBLs基因分型和质粒定位。结果：革兰阴性苗ESBLs的检出率为14．6％（173／1184）；获得产ESBLs接合子67株，电转化子11株，其中产CTX－M－14型ESBLs为33．3％（26／78）、CTX－M－3为23．1％（18／78）、CTX－M－9为14．1％（11／78）及SHV-2a为2．6％（2／78），未定型为5．1％（4／78）；29．5％（23／78）野生株伴广谱酶TEM－1或SHV－1型；各型ESBLs基因约定位在35－190kb大小的可接合性低执行者拷贝数天然质粒上；CTX－M型ESBLs以对头孢噻肟高水平高耐为特征。结论：华南地区质粒介导的ESBLs以CTX－M型衍生酶为主，其次是SHV型酶。     

柯萨奇B4病毒非结构蛋白P2C重组质粒的构建

目的：构建柯萨奇B4病毒非结构蛋白P2C重组质粒。方法：用RT-PCR技术，从柯萨奇B4病毒中钓取非结构蛋白P2C cDNA片段，克隆入PUCan-T载体，转化大肠杆菌DH5α，构建重组质粒。结果：以柯萨奇B4病毒的总RNA为模板，扩增出987bp大小的片段，克隆入PUCan-T载体，用BamHⅠ、HindⅢ双酶切鉴定，与非结构蛋白P2C的PCR扩增产物片段大小一致。结论：成功地构建了柯萨奇B4病毒非结构蛋白P2C重组质粒。     

酵母双杂合系统AD端阴离子交换蛋白C-末端表达质粒的构建

利用PCR方法，从阴离子交换蛋白1（AE1）全长cDNA中扩增出约350bp c末端cDNA片段，测序后将其克隆至pGADT7载体上，用醋酸锂法构建好的pADT7-AE1-c末端转染酵母菌HA109，观察其在选择性培养基上的表达情况。结果表明，获得了530bp AE1c－末端cDNA,pGADT7-AE1-c末端对酵母无毒性，不能激活检测基因，可作为酵母双杂合系统中的靶基因。     

人白细胞介素-3基因cDNA的克隆及其真核表达质粒的构建

目的:克隆人白细胞介素-3(hIL-3)基因cDNA,构建其真核表达质粒pcDNA3/hIL-3。方法:从人外周血单个核细胞中提取IL-3mRNA,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增IL-3基因cDNA,通过T/A克隆法,首先构建pUCm-T/hIL-3,然后构建其真核表达型载体pcDNA3/IL-3。结果:pUCm-T/hIL-3内插入片段序列与hIL-3基因序列一致;pcDNA3/IL-3经酶切鉴定与预期结果一致。结论:成功完成了hIL-3基因克隆和pcDNA3/IL-3真核表达质粒的构建。     

肝再生增强因子对外原性抗原引起机体免疫应答影响的研究

目的 研究rALR对HBsAg及BSA免疫大鼠产生抗体、细胞因子和对脾脏细胞增殖的影响.方法 甲醇诱导表达rALR,测定活性并进行以下研究.①rALR对HBsAg免疫的影响:实验分为:生理盐水、HBsAg20 μg/只、HBsAg20 μg rALR100 μg/kg、HBsAg20 μg rALR 25 μg*kg、HBsAg20 v pPIC9K表达上清、HBsAg20 μg CsA10mg/kg,共6组;②rALR对BSA免疫的影响:实验分为:生理盐水、BSA25 μg/只、BSA25 μg rALR100 μg/kg、BSA25 μg pPIC9K表达上清、BSA25 μg CsA10 mg/kg,共5组.以上均皮下注射免疫大鼠,1次/周×4次,ELISA检测血清中相应抗体、IL-2和IFN-γ.③rALR对大鼠脾细胞增殖的影响:Wisar大鼠先皮下注射HBsAg(20 μg/只)1次,2周后处死,分离脾单核细胞,种板,再加HBsAg 1 μg/孔和/或相应处理因素(rALR、空质粒表达产物等),48h后加3H-TdR,12 h后收集细胞,检测cpm值.结果 rALR100 μg/kg HBsAg组的8只动物中,有2只出现抗HBs的抗体,空质粒对照组和单用HBs Ag组8只动物均出现抗HBs.rALR 100 μg/kg BSA组的8只动物中,有3只出现抗BSA抗体,空质粒对照组和单用BSA组8只动物均出现抗BSA的抗体.rALR 100μg/kg能明显抑制细胞因子IL2及IFN-γ的产生.rALR4μg体外能明显抑制脾细胞的增殖.结论 rALR能抑制HBsAg和BSA诱导大鼠产生相应抗体及IL-2、IFN-γ的产生;体外能抑制经体内致敏的脾细胞的增殖,说明rALR有免疫抑制作用.     

一种新的质粒介导的IMI-1型碳青霉烯酶

目的　确立亚胺培南耐药阴沟肠杆菌对亚胺培南的耐药机制。方法　采用Etest测定抗菌药物最低抑菌浓度 (MIC) ,通过等电点聚焦电泳 (IEF)、三维试验、接合试验、Southern杂交、聚合酶链反应 (PCR)、克隆测序对酶的活性及编码基因进行研究。结果　阴沟肠杆菌产碳青霉烯酶 ,等电点为 8.1。该酶能被克拉维酸抑制 ,不被氯唑西林、EDTA抑制 ,存在 2f类酶的某些特性 ,其耐药基因位于 80kb左右的质粒上。克隆测序显示与染色体介导的IMI 1有 99%的同源性。结论　阴沟肠杆菌对亚胺培南耐药是由一种新的质粒介导的与染色体介导的IMI 1类似的碳青霉烯酶所致。