重组人bFGF的原核表达及其高效价抗血清的制备

目的 以重组人碱性成纤维生长因子为免疫原，制备高效价抗hbFGF抗血清。方法通过PCR方法改造5’编码区的12个密码子，构建hbFGF’原核表达载体并在大肠杆菌(E．coli)中表达，以纯化的hbFGF、免疫新西兰兔，制备高效价抗血清，用于重组hbFGF、的免疫印迹分析。结果经过改造的hbFGF基因在E．coli中获得较高水平表达。从可溶性部分纯化得到纯度95％以上的重组hbFGF，以该重组蛋白免疫兔子，在二次加强后以间接ELISA检测抗血清效价可达1：512000。免疫印迹分析显示该抗血清与E．coli中表达的重组hbFGF、和标准hbFGF、均有特异性反应，但与某些细菌蛋白存在弱交叉反应，经E．coli菌体蛋白吸附的抗血清，与菌体蛋白的弱交叉反应消失。结论以纯化的重组hbFGF为免疫原制备了高效价的特异性抗血清，经菌体蛋白吸附可消除存在的交叉反应性。     

乙型肝炎病毒正链转录及调节的研究进展

乙型肝炎病毒正链转录体(HBV asRNA),通过与HBV负链转录产生的mRNA互补结合成双链RNA(dsRNA),在核内或胞质中下调病毒的转录与表达,是病毒复制表达的重要自身调节分子。HBV通过抑制正链的转录,保护负链的转录产物作为逆转录及翻译相应病毒蛋白的模板,促进自身的复制与表达。因此,研究HBV正链的转录与调节,能深入对HBV分子病毒学机制的探索,为今后的抗病毒治疗提供新的思路。     

人跨膜蛋白39A原核表达载体构建、条件优化及可溶性表达

目的构建人跨膜蛋白39A基因(TMEM39A)的原核表达载体,优化表达条件并获得可溶性表达的TMEM39A。方法以HEK293细胞的总RNA为模板,反转录PCR扩增TMEM39A,构建其原核表达载体pGEX-6P-1-TMEM39A,并在不同温度、IPTG浓度、A_(600nm)值及时间条件进行诱导表达,然后利用上述获得的最佳诱导条件进行大量表达,分析其可溶性和抗原性。结果重组表达载体pGEX-6P-1-TMEM39A与GenBank中的TMEM39A(登录号:BC021277.2)的核苷酸序列同源性为99.9%,氨基酸序列同源性为100%。重组蛋白GST-TMEM39A在69和60 ku处出现两条特异性条带,采用单因素方法对不同温度、IPTG浓度、A_(600nm)值及时间进行分析得出GST-TMEM39A的最佳诱导条件为25℃、A_(600nm)值为0.6～0.8、IPTG浓度为0.1 mmol/L诱导9 h;在此基础上进行大量表达,并以可溶性形式获得了TMEM39A与GST蛋白的融合表达。结论成功构建了TMEM39A的原核表达载体,确定了GST-TMEM39A的最佳表达条件并实现其的可溶性表达,为后续纯化TMEM39A、制备抗体开展功能研究奠定物质基础,并为深入探讨TMEM39A与许多疾病或病毒的关系提供科学依据。     

氯霉素乙酰转移酶检测(CAT assay)

本文介绍一种快速方便的外源基因在哺乳动物细胞中瞬间表达检测系统,即氯霉索乙酰转移酶检测系统。该项检测技术不仅对基因的调控顺序(Cis-acting elements)如启动子、增强子等检测提供了有效的工具,而且为真核基因在哺乳动物细胞表达体系中,质粒的构建及筛选提供了行之有效的手段。并介绍了该技术的全过程及其操作要点。     

小鼠食管肌层的发育

应用免疫组化PAP法和TUNEL凋亡染色法，对小鼠胚胎及生后1～5天食管肌层的发育进行了研究，以阐明小鼠食管肌层的分化发育特点。结果显示：α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)是食管肌层最先表达的标志蛋白。ED12(胎龄12天)的食管上段，α-SMA表达限于后壁间充质细胞。中段以下，可见α-SMA弱阳性细胞形成不连续环形围绕食管腔。ED13，     

CD54和LFA-1的相互作用在6A8α-甘露糖苷酶表达抑制的JurkatT细胞的黏附性增强中的作用

目的研究CD54和LFA-1的相互作用在6A8 α-甘露糖苷酶表达抑制的Jurkat细胞(AS)的黏附性增强中的作用。方法用细胞凝集试验确证AS细胞间黏附的增强，用细胞与细胞间黏附分子-1-人IgG的Fc片段(ICAM-1-Fc)的黏附试验和阻断性抗CD11a抗体的阻断试验研究CD54-LFA-1的作用，用单克隆抗体MEM-148检测As细胞LFA-1亲和力的变化，用单克隆抗体NKI-L16检测AS细胞LFA-1亲合力的变化，用鬼笔环肽染色细胞骨架，用Jurkat-Raji细胞间的作用作模型研究6A8α-甘露糖苷酶表达抑制对T和B细胞间黏附的影响，用ConA结合试验检测细胞中蛋白质N-糖基化的变化。结果(1)AS细胞间的黏附性增强主要与CD54及CD11a表达的增强相关，也与LFA-1亲和力的增高相关；(2)AS细胞的细胞骨架发生重排；(3)As细胞与Raji细胞间的黏附也增强；(4)ConA与AS细胞的结合增强。结论CD54和LFA-1的相互作用在AS Jurkat T细胞的黏附性增强中起重要作用。细胞骨架重排也可能起作用。As细胞的蛋白质发生了N-糖基化修饰。     

顺式串联双拷贝DuIFN—γ基因的真核表达

目的：以鸭γ－干扰素（DuIFN-γ)基因为目的基因,研究同一启动子调控下,不同拷贝数的目的基因的表达状况。方法：采用基因重组技术构建含DuIFN-γcDNA单拷贝和双拷贝重组质粒并转入真核细胞COS－7中进行表达。DuIFN-γ活性采用Griess试剂检测。结果：双拷贝重组质粒和单拷贝重组质粒50％最大活性稀释度分别为1：320和1：160。双拷贝重组质粒转染上清稀释10240倍后,仍保留DuIFN-γ活性,而单拷贝重组质粒转染上清经1280倍稀释后,即丧失活性。结论：在同一启动子作用下,顺式插入双拷贝目的基因可明显增强目的基因在真核细胞中的表达量。     

乙肝基因疫苗系列质粒的构建及其在真核细胞中的表达

目的 构建一系列乙肝病毒表面抗原大、中、小蛋白的真核细胞表达质粒,并研究其在真核细胞中的表达情况。方法 采用常规PCR法扩增S、前S2－S、前S1－前S2－S片断,利用重叠PCR法扩增出前S1－S片断后,分别插入Rc/CMV及pSG5UTPL/Flag载体质粒中,并在其ATG起始密码前加入KOZAK序列后转染SP2／0细胞,Western-Blot杂交检测所表达蛋白,并用核酸自动分析仪分析所插入片断的核酸序列。结果 插入片断的核苷酸序列与相应的大、中、小蛋白和前S1－S蛋白的编码基因一致,Western-Blot杂交检测出了相应的目的蛋白。结论 获得了8个能高效表达乙肝病毒表面抗原大、中、小蛋白和前S1－S蛋白的真核细胞表达质粒。     

尖锐湿疣Fas、bcl—2、Ki—67的表达与细胞凋亡的关系

OBJECTIVE: This study inquired into the significance and relationship of apoptosis to the regulation and proliferation of condyloma acuminatum(CA). METHODS: Apoptotic cells were detected in situ by terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated-dUTP nick end labeling (TUNEL). The detection of Fas, bcl-2 and Ki-67 expression was performed using immunohistochemical staining in 28 specimens of CA. RESULTS: Apoptotic cells were found in 24 cases (85.7%) in keratinocytes. All of the in 28 cases(100%) had Fas and Ki-67 positive expressions, but only 8 cases (28.6%) had bcl-2 mild or moderate expression. The disease severity (serious, moderate and mild) groups did not significantly differ in apoptotic index (AI), Fas, bcl-2 and Ki-67 positive expression (P > 0.05). There was positive correlation between AI and Fas(r = 0.866, P = 0.000). bcl-2 and Ki-67 were negatively correlated with AI (r = -0.416, P = 0.018; r = -0.475, P = 0.006). CONCLUSION: It is suggested that apoptosis in keratinocytes may play an important role in inhibiting the proliferation of virus, that Fas may be an upregulative factor and bcl-2 may be an inhibition factor to apoptosis, and that excessive Ki-67 expression may be associated with the acceleration of cell cycle.     

本刊对统计学方法中结果表达的有关要求

在统计学方法的表达中,当P<0.05(或P<0.01)时,应说对比组之间的差异具有统计学意义,而不应说对比组之间具有显著性(或非显著性)差异;应写明所用统计学方法的具体名称(如:成组设计资料的t检验、两因素析因设计资料的方差分析、多个均数之间两两比较的q检验等);在用不等式表示P值时,一般情况下选用P>0.05、P<0.05和P<0.01三种表达方式即可满足需要,无需再细分为P<0.001或P<0.0001。