基因重组融合蛋白hNPY对小鼠前脂肪细胞增殖和分化影响的实验研究

目的：前脂肪细胞是一类具有增殖和向脂肪细胞分化潜力的特异化的前体细胞,如能找到可促进前脂肪细胞增殖和分化的因子或药物,并在脂肪组织移植的同时使用,则有希望提高脂肪组织的移植效果,本实验探索一种新的人体肥胖关联基因和外周脂肪细胞激动剂一基因重组融合蛋白hNPY对小鼠3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化的影响及其分子调控机制。方法：采用基因工程技术设计hNPY基因上下游序列,经过PCR反应合成hNPY的cDNA后与pET28a＋载体重组,再将已构建好、并经测序确认无误的重组质粒pET28a—NPY转导至大肠杆菌BL21（DE3）,再由IPTG诱导表达hNPY融合蛋白、并进行纯化;然后,将体外培养的小鼠3T3-L1前脂肪细胞经由3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、胰岛素和地塞米松进行联合诱导;诱导2d后,再将此细胞分为三组,即空白对照组（未加任何诱导剂组）、经典诱导组（胰岛素诱导）和实验干预组（hNPY融合蛋白干预）,其中,实验干预组再按照hNPY融合蛋白浓度不同又分为高、中、低三个浓度组（10^-8mol／L、10^-19mol／L和10^-9 mol／L）。分别于细胞培养的第7d和第12d用相差显微镜观察各组细胞的形态学变化,再于细胞培养的第12d用油红O染色观察脂肪细胞的分化程度;同时,采用MTT法检测该细胞的增殖状况;采用Westernblot法检测脂肪细胞分化相关基因过氧化物体增殖剂活化受体-γ（PPAR-γ）、CAAT／增强子结合蛋白-a（C／EBP-a）蛋白的表达水平。结果：低浓度（10^-10 mol／L）的hNPY融合蛋白,无明显促进小鼠3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化的作用效果;中浓度（10^-9 mol／L）的hNPY融合蛋白,可有效促进小鼠3T3-L1前脂肪细胞增殖及细胞数量增多;而高浓度（10^-8 mol／L）的hNPY融合蛋白,不仅能明显促进小鼠3T3-L1前脂肪细胞的细胞增殖和分化,且能显著提高该细胞C／EBPa和PPARγ的表达水平、而明显降低INSIG-2的表达。结论：高浓度（10^-8mol／L）的基因重组融合蛋白hNPY能够明显促进小鼠3T3-L1前脂肪细胞的增殖和分化,其促进3T3-L1细胞增殖和分化的分子调控机制很可能与上调PPARγ、C／EBPa表达和降低INSIG-2表达水平有关,这提示：hNPY作为脂肪细胞膜上受体NPYR的有效促进剂或激动剂,未来很可能成为人体外周脂肪细胞一个新的作用靶点。     

Unravelling hair follicle–adipocyte communication

Here, we explore the established and potential roles for intradermal adipose tissue in communication with hair follicle biology. The hair follicle delves deep into the rich dermal macroenvironment as it grows to maturity where it is surrounded by large lipid‐filled adipocytes. Intradermal adipocytes regenerate with faster kinetics than other adipose tissue depots and in parallel with the hair cycle, suggesting an interplay exists between hair follicle cells and adipocytes. While adipocytes have well‐established roles in metabolism and energy storage, until recently, they were overlooked as niche cells that provide important growth signals to neighbouring skin cells. We discuss recent data supporting adipocytes as niche cells for the skin and skin pathologies that may be related to alterations in skin adipose tissue defects.     

hsa-miR-335靶基因预测及生物信息学分析

目的对hsa-miR-335进行系统的生物信息学分析,预测hsa-miR-335可能参与的生物学过程,为本研究小组深入研究其在脂肪细胞分化中的功能和机制奠定基础。方法通过miRbase获取并分析hsa-miR-335序列特征;应用TargetScan,PicTar及miRanda预测hsa-miR-335的靶基因,并结合已证实的靶标基因,进行功能注释（Gene Ontol-ogy）和Pathway富集分析（Pathway Enrichment）。应用NCBI Mapviewer、UCSC Genome Browser等工具对hsa-miR-335进行启动子相关预测。结果 miR-335在各物种之间具有高度保守性,其靶基因功能富集于胰腺外分泌、脂质激酶活性调控、wnt受体信号的调控、细胞周期等生物学过程（P〉0.01）,其靶基因信号通路富集于促性腺激素释放激素信号通路、MAPK信号通路、胰岛素信号通路、细胞周期等信号转导通路（P〈0.05）。启动子预测提示hsa-miR-335为基因内miRNA,在基因组上下游10kb以内存在CpG岛,转录起始位置（TSS）、Poly A信号、转录因子结合位置（TFBS）。结论 hsa-miR-335预测的靶基因集合富集于多个生物学过程,与肥胖密切相关,并可能存在其独立的转录调控机制。为后续miR-335在肥胖人脂肪细胞中生物学功能研究奠定基础。     

改进的“天花板”组织块培养法与消化培养法培养前脂肪细胞的对比研究

目的:对比改进的天花板组织块培养法与消化培养法培养前脂肪细胞的优劣。方法:两种方法获得的前脂肪细胞,培养3天,显微镜下检测自分化情况,MTT、流式细胞仪检测其增殖情况和细胞周期。培养9天,绘制生长曲线。使用含胰岛素、甲状腺素T3和转铁蛋白(ITT)的无血清培养基诱导获得的前脂肪细胞5天,拍照测细胞直径,油红染色法检测其分化情况。结果:改进的天花板组织块培养法培养的第一代自分化存在,但是发生自分化的细胞很少。增殖和分化结果均无显著性差异。但是此法在同等情况下获得细胞较多,所需经费较少。结论:与消化培养法相比较而言,改进的天花板组织块培养法是一种更加简单、经济的获得大鼠前脂肪细胞的方法。     

全反式维甲酸调控BMP9诱导3T3-L1前脂肪细胞成骨和成脂分化

目的 研究全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)调控骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)诱导前脂肪细胞成骨和成脂分化的作用及相关机制.方法 首先用RTPCR检测维甲酸受体在3T3-L1前脂肪细胞中的表达;用BMP9编码序列的重组腺病毒感染3T3-L1细胞,再以1 μmol/L的ATRA干预不同时间后,利用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性测定和染色、Western blot检测骨桥素(osteopontin,OPN)、骨钙素(osteocalcin,OC)和脂肪酸结合蛋白(adipocyte fatty acid binding protein,aP2)表达,茜素红染色检测钙盐沉积水平,油红O染色检测脂质积聚研究BMP9和ATRA对前脂肪细胞成骨和成脂分化的作用;利用荧光素酶报告质粒和Western blot检测ATRA对BMP9介导的BMPR-Smad信号通路活性的影响.结果 前脂肪细胞中,除视黄醇受体γ外其余5种维甲酸受体均有表达;BMP9能增加前脂肪细胞ALP活性(P＜0.01),并促进OPN及OC蛋白表达和钙盐沉积,ATRA能进一步增强该作用(P＜0.01);BMP9能促进前脂肪细胞中脂质积聚,并诱导aP2表达,但该作用被ATRA抑制;ATRA还能够上调细胞中BMP9的mRNA和蛋白表达,BMP9合并ATRA组的Samd1/5/8磷酸化水平明显强于BMP9组,BMPR-Smad报告质粒荧光素酶活性也呈相同变化趋势(P＜0.01).结论 在前脂肪细胞中,ATRA能增强BMP9的成骨诱导活性,并抑制其诱导的成脂分化;ATRA的作用可能与进一步激活BMP9介导的BMPR-Smad信号有关.     

重组人成纤维细胞生长因子21降糖作用研究

目的利用肝细胞、肌肉细胞,前脂肪细胞及ob/ob小鼠进行rhFGF21体内外降糖作用研究。方法培养人正常肝细胞(HL-7702),大鼠肌肉细胞(L-6),小鼠前脂肪细胞(3T3-L1),用GOD-POD试剂盒测定细胞葡萄糖吸收量;FGF-21按照每天0.6μg·g-1的剂量颈部皮下连续注射7d,分别在d 0、d 3、d 7给药后1 h检测空腹血糖,以生理盐水做对比;rhFGF-21按照每天0.6μg·g-1的剂量颈部皮下连续注射9 d,末次给药后1 h开始口服糖耐量实验,灌胃给予2 mg.g-1的葡萄糖溶液,分别于给予葡萄糖溶液后30、60、120 min检测血糖;rhFGF-21按照每天2.5μg·g-1的剂量颈部皮下注射连续7 d,在d 0、d 3、d 7给药后1 h检测餐后血糖。结果在3.9 mg·L-1～100 mg·L-1间rhFGF21促进HL-7702细胞葡萄糖的吸收且呈现浓度-效应关系,与对照组相比差异有显著性(P<0.01);在0.3 mg·L-1～250 mg·L-1间rhFGF21促进L6肌细胞对葡萄糖的吸收,与对照组相比差异有显著性(P<0.05);在12.6 mg·L-1～100 mg·L-1间rhFGF21促进分化的3T3-L1细胞葡萄糖的吸收且呈现浓度-效应关系,与对照组相比差异有显著性(P<0.05);ob/ob小鼠血糖测试证明,rhFGF-21具有降血糖和改善葡萄糖耐受量的作用。结论 rhFGF21体外可促进肝细胞、肌肉细胞及脂肪细胞葡萄糖的吸收;rhFGF-21可降低ob/ob小鼠空腹血糖及餐后血糖,具有改善其葡萄糖耐受量的作用。     

人miR-1908慢病毒载体构建及在人脂肪前体细胞中的表达验证

目的 构建人miR-1908慢病毒表达载体,包被病毒并检测其在人脂肪前体细胞中过表达效果。方法 以人脂肪细胞基因组DNA为模板,PCR高保真扩增包含miR-1908区域上下游各100bp左右的基因组DNA,亚克隆入慢病毒表达载体,与包装质粒共转染HEK-293T细胞,包装病毒,收取病毒上清,纯化后感染人脂肪前体细胞,36 h开始观察荧光标记,72 h收取细胞,抽提RNA,Realtime PCR检测慢病毒感染下miR-1908的相应表达量。结果 成功构建人miR-1908慢病毒表达载体,包装获得的病毒感染人脂肪前体细胞的效率可达到70%以上,miR-1908过表达水平可接近2倍。结论 本研究成功构建了人miR-1908慢病毒过表达载体,包被的慢病毒可以在人脂肪前体细胞中实现过表达效果,为后续功能研究奠定了基础。     

In vitro analysis of the interactions between preadipocytes and endothelial cells in a 3D fibrin matrix

The volume‐persistent survival of transplanted adipose tissue in vivo relies on early vascularization, due to an otherwise early induction of apoptosis of the centrally located cells. Thus, one way to enable the early formation of a capillary network resulting in a sufficient perfusion of the transplanted construct might be the co‐transplantation of autologous preadipocytes with endothelial cells. To investigate preadipocyte–endothelial cell interaction, three‐dimensional proliferation‐ and angiogenesis assays were performed in vitro. Proliferation rates of co‐cultured endothelial cells and preadipocytes suspended in a fibrin matrix were elucidated by Alamarblue assays. The spheroid angiogenesis model was applied for analyzing the effects of vascular endothelial cell growth factor (VEGF) and basic fibroblast growth factor (bFGF) (produced by preadipocytes) as well as the impact of cell‐cell interaction between preadipocytes and endothelial cells and fibrin matrix on endothelial cell migration. Preadipocytes proliferated in fibrin glue, whereas endothelial cells underwent apoptosis. By co‐culturing, both cell types demonstrated an increased proliferation rate. Preadipocytes provoked migration of endothelial cells. Blocking bFGF and/or VEGF led to a significant decrease of migration. Changes in fibrin structure were followed by migration of single cells instead of sprouting. An appropriate fibrin matrix as well as already differentiated endothelial cells are necessary for preadipocytes to develop their angiogenic activity via bFGF and VEGF.     

六味地黄方超微饮片含药血清对大鼠前脂肪细胞的影响

目的 探讨六味地黄方超微饮片含药血清对大鼠前脂肪细胞增殖与分化的影响。方法原代培养大鼠前脂肪细胞。用四甲基偶氮唑盐（MTT）方法检测六味地黄方超微饮片含药血清对前脂肪细胞的增殖情况。以酶组织化学法检测其对前脂肪细胞分化过程中的磷酸甘油脱氢酶（GPDH）的影响。油红O染色方法测定其对细胞内脂肪积聚的影响。结果10．0％、5．0％、2．5％浓度的六味地黄方超微饮片舍药血清对大鼠前脂肪细胞增殖的影响与空白血清比较,差异均有统计学意义（P〈0．05）。10．0％、5．0％浓度的六味地黄方超微饮片舍药血清对大鼠前脂肪细胞分化过程中脂肪积聚的影响,与空白血清比较,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论六味地黄方超微饮片能促进大鼠前脂肪细胞的增殖,抑制大鼠前脂肪细胞的分化。