中药肝毒性研究方法技术的新进展及其应用

中药肝毒性问题受到了日益广泛的重视。目前,肝细胞系、亚细胞、三维培养、模式动物等体内体外模型在中药肝毒性的筛选中发挥着重要作用。随着现代系统观和整体论的引入,基因组学、蛋白质组学、代谢组学以及网络毒理学等新方法开始逐步应用于中药肝毒性标志物挖掘和肝毒性预警等方面。该文通过总结近年来中药肝毒性研究领域的成果,分析和探讨其中存在的主要问题,提出具有中医药特色的"结合病/证模型和网络毒理学的中药量-效-毒关系研究"的新思路,同时也对该课题组开展的淫羊藿潜在肝毒性的初步研究进行了概述,希望能为中药肝毒性的评价方法和技术指导原则提供理论基础,推动中药肝毒性研究体系的发展与完善。     

淫羊藿对哮喘大鼠肺组织RANTES及MCP-3表达的影响

目的 观察补肾中药淫羊藿对哮喘大鼠肺组织调节激活正常T细胞表达和分泌因子(regulated on activation, normal T cell expressed and secreted,RANTES)、单核细胞趋化蛋白3（monocyte chemotactic protein-3,MCP-3）表达的影响,进一步探讨淫羊藿防治哮喘的作用机制。 方法 将挪威大鼠随机分成6组：正常组、模型组、阳性药组（给地塞米松）、淫羊藿低、中、高剂量组（分别给淫羊藿0.125、0.5、2.0 g/mL)。用Real-time PCR法检测肺组织RANTES、MCP-3 mRNA的表达,ELISA法检测各组血清中肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素（IL）4、5的含量。结果 与模型组比较,各用药组大鼠肺组织RANTES、MCP-3 mRNA的表达下调（P＜0.05或P＜0.01）,TNF-α水平均明显降低（P=0.000）,阳性药组和淫羊藿中、高剂量组IL-4水平均明显下降（P=0.007,P=0.047,P=0.033）, IL-5水平仅见阳性药组和淫羊藿高剂量组显著下降（P=0.003,P=0.005）。结论 哮喘发作期给予淫羊藿可减轻哮喘气道炎症,并且其与抑制肺组织RANTES、MCP-3表达有关。     

淫羊藿总黄酮对去势大鼠骨密度的影响

目的:探讨淫羊藿总黄酮对去势大鼠骨密度的影响。方法:取10月龄雌性SD大鼠60只,随机分为正常组、模型组、雌激素组和淫羊藿低、中、高剂量组,每组10只。除正常组外,其余各组大鼠均行双侧卵巢切除术,术后1周分别给予生理盐水、淫羊藿总黄酮和雌激素进行干预,共90天,观察各组大鼠全身、股骨及腰椎骨密度的变化。结果:正常组和雌激素组大鼠全身骨密度均显著高于其他各组(P均0.05);淫羊藿总黄酮低、中、高剂量组大鼠全身骨密度与模型组比较,差异无统计学意义(P0.05);淫羊藿总黄酮低、中、高剂量组大鼠股骨骨密度显著高于模型组(P0.05),淫羊藿总黄酮中、高剂量组大鼠腰椎骨密度显著高于模型组(P0.05)。结论:淫羊藿总黄酮能明显抑制去势大鼠股骨及腰椎骨密度的降低,对去势大鼠全身骨密度无明显影响。     

淫羊藿对激素性股骨头坏死兔模型血钙血磷的影响

目的：观察淫羊藿提取液对激素性股骨头坏死兔模型血钙、血磷变化及骨密度的影响,探讨淫羊藿提取液的作用机理。方法：所选用动物随机分为空白组10只,造模组20只。所有参加造模组动物第一次应用马血清10 mL·kg-1,经兔耳缘静脉注射;间隔3周后,再次经兔耳缘静脉注射马血清6 mL·kg-1;间隔2周后,按45 mg·kg-1的剂量给予甲基强的松龙腹腔注射,连续3 d,每天注射1次。注射激素期间,为了预防感染,每只动物每天腹腔注射青霉素10×104 U,连续7 d。预防感染。空白组动物常规饲养。造模完成后随机选取空白组、造模组动物各一只解剖出股骨头做病理观察,证实造模成功（空气栓塞法处死）。随后空气栓塞法处死造模动物3只及空白组动物1只（总共4只）,至最后一次注射激素后将所剩造模组16只动物随机分为两组即模型组和实验组。空白组和模型组动物每天给予10 mL生理盐水灌胃,实验组动物每天给予10 mL淫羊藿提取液灌胃,共连续灌胃8周,8周后检测各组动物血钙、血磷及骨密度变化情况。结果：给药8周后空白组（2.478±0.117） mmol·L-1与实验组（2.330±0.135）mmol·L-1血磷比较,差异有统计学意义（ P>0.05）;空白组、实验组和模型组（1.301±0.186）mmol · L-1血磷比较,有统计学意义（ P <0.05）。空白组（1.081±0.333）mmol · L-1与实验组（1.201±0.281）mmol·L-1血钙相比较,差异无统计学意义（P>0.05）;空白组、实验组和模型组（1.336±0.359）mmol·L-1血钙比较,差异有统计学意义（P<0.05）。给药8周后空白组骨密度为（0.2035±0.0148）g·cm-2,高于模型组（0.1689±0.0119） g·cm-2,二者比较差异,差异有统计学意义（P<0.05）;空白组与实验组（0.1923±0.0082）g·cm-2比较,二者比较差异有统计学意义（P<0.05）;实验组、空白组和模型组骨密度比较,二者比较,差异有统计学意义（P<0.05）。结论：糖皮质激素能够降低血磷水平而升高血钙水平,淫羊藿提取液能够降低糖皮质激素引起的高血钙水平及升高糖皮质激素引起的低血磷水平。     

淫羊藿及其拆分组配伍麻黄对急性肾小球肾炎水肿模型大鼠影响

目的通过研究淫羊藿及其拆分组配伍麻黄对冰水浴联合注射牛血清白蛋白所致急性肾小球肾炎水肿模型大鼠的影响,探究淫羊藿配伍麻黄的利水作用及淫羊藿发挥利水作用的物质基础。方法先将SD雄性大鼠置于代谢笼内适应性喂养3 d。随机取10只大鼠作为空白对照组,其余大鼠于实验第1~3天冰水浴至大鼠四肢僵硬先造成大鼠风寒感冒模型;再于实验第4天和第11天早上9∶00按150 mg·kg^-1给大鼠腹腔注射牛血清白蛋白(BSA),空白对照组则注射等量的生理盐水。取造模成功大鼠60只,随机分成6组,每组10只,分别为:模型组,麻黄+生淫羊藿组,麻黄+多糖组,麻黄+非黄酮组,麻黄+大极性黄酮组,麻黄+小极性黄酮组。各组大鼠从实验第15天开始按照10 mL·kg^-1灌胃给予相应试剂,空白组给予等体积蒸馏水,连续灌胃20 d。收集实验大鼠第34天24 h尿液,大鼠处死后,测定尿蛋白、血清肌酐、血清尿素氮、白细胞、中性粒细胞百分比、血小板指标含量。取肾脏组织用于做病理切片并于HE染色。结果麻黄+生淫羊藿组尿蛋白含量由显著性下降(P<0.05),血清肌酐、血清尿素氮、中性粒细胞百分比有极显著性下降(P<0.01);部分肾小球周围有少量的炎性细胞,炎性细胞浸润有所减轻。麻黄+非黄酮组血清肌酐、白细胞数量、中性粒细胞百分比有显著性下降(P<0.05),尿蛋白、血清尿素氮水平有极显著性下降(P<0.01);肾小球肿胀有所减轻,有囊腔变小。麻黄+大极性黄酮组中性粒细胞百分比有极显著性下降(P<0.01);肾小球依旧有肿胀,炎性细胞浸润减少。麻黄+小极性黄酮组血清尿素氮、中性粒细胞百分比有及显著性下降(P<0.01);肾小球肿胀有减轻,肾小球附近的炎性细胞浸润有减少。麻黄+多糖组肾小球依旧充血肿胀,依旧有炎性细胞浸润,有肾小管扩张。结论淫羊藿及其拆分组配伍麻黄对急性肾小球肾炎水肿模型大鼠有较好的治疗作用,且疗效为:麻黄+非黄酮组>麻黄+生淫羊藿组>麻黄+小极性黄酮组>麻黄+非极性黄酮组>麻黄+多糖组,淫羊藿主要利水作用物质基础为非黄酮成分。     

淫羊藿激活内源性干细胞及其机制研究

干细胞是具有自我更新与增殖分化能力的细胞,通过激活内源性的干细胞而改善再生反应为治疗退行性疾病提供了一个新的思路。笔者在皮质酮大鼠（肾阳虚证模型）观察到淫羊藿总黄酮（EF）能促进肾上腺皮质干细胞的增殖、迁移,采用基因芯片技术发现EF对皮质酮大鼠生长激素（GH）、生长激素释放激素（GHRH）及各类促生长因子如胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBP）、神经生长因子（NGF）等具有显著上调作用。在自然衰老大鼠（肾虚证模型）发现EF能使多个组织的基因表达年轻化,也使老年大鼠下调的GH、GHRH及IGFBP、NGF等的表达上调。采用体外分离的胚鼠神经干细胞进一步证明淫羊藿及其提取物对干细胞具有直接促增殖作用。上述一系列的研究提示淫羊藿及其提取物对干细胞的作用可能是其拮抗糖皮质激素对下丘脑－垂体－肾上腺轴的抑制和延缓衰老的细胞学基础;也表明中医药可通过动员与提高激素、细胞因子水平激活内源性干细胞,发挥机体储备的潜力而治疗疾病。     

淫羊藿次苷Ⅰ在大鼠体内的药动学和组织分布研究

 目的研究淫羊藿次苷Ⅰ在血液和各组织中的HPLC检测方法及在大鼠体内的药动学和组织分布。方法采用Dikma-C₁₈色谱柱(4.6mm×250mm,5μm),流动相甲醇-0.2%磷酸(73:27),流速1.0mL·min^-1,检测波长270nm,柱温20℃。大鼠按淫羊藿次苷Ⅰ单剂量10mg·kg^-1尾静脉注射后,采用高效液相色谱法测定给药后不同时间的淫羊藿次苷Ⅰ血药浓度和各组织浓度,用3P97程序计算药动学参数。结果淫羊藿次苷Ⅰ的血药浓度-时间曲线符合二室模型,并在心脏和肌肉组织有一定程度的蓄积。结论此方法简便、准确、稳定,可用于淫羊藿次苷Ⅰ的药动学和组织分布研究。     

淫羊藿多糖硫酸化修饰条件的优化

目的 优化淫羊藿多糖硫酸化修饰的最佳条件.方法 采用氯磺酸-吡啶法.以硫酸基取代度和糖的质量分数为指标,采用L9(34)正交试验对反应温度、试剂配比和反应时间进行优选.结果 反应温度对修饰的影响最大,适宜的修饰条件为反应温度80℃,氯磺酸与吡啶的体积比在1:8～1:10,反应时间2～3h.结论 采用优化的条件对淫羊藿多糖进行硫酸化修饰可以获得理想的硫酸化淫羊藿多糖.     

淫羊藿总黄酮拮抗皮质酮大鼠肾上腺皮质细胞凋亡的研究

目的:研究淫洋藿总黄酮(EF)拮抗糖皮质激素副作用,保护肾上腺皮质功能的机制。方法:采用肾上腺重量指数评价EF应用后萎缩的肾上腺皮质恢复情况;分离肾上腺细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡率;并用末端脱氧核苷酸转移酶介导缺口末端标记法(TUNEL)原位检测细胞凋亡;用大鼠全基因组表达谱芯片检测凋亡相关基因表达。结果:与正常组相比,皮质酮组肾上腺重量指数显著下降,肾上腺细胞凋亡率明显上升,P<0.05;EF治疗后,肾上腺重量指数升高,细胞凋亡率明显下降,P<0.05。TUNEL显示正常组、皮质酮组、EF组每张切片平均凋亡细胞数分别为4.67±1.53、70.67±9.29、18.67±7.64;基因芯片发现正常大鼠肾上腺有53个凋亡相关基因表达,其中39个具有促凋亡活性,14个基因具有抗凋亡活性,促凋亡基因和抗凋亡基因组成了一个网络,皮质酮使3个具有抗凋亡活性的基因下调,EF治疗使具有抗凋亡活性AMP激活蛋白激酶α1催化亚单位基因和丝裂原激活蛋白激酶8相互作用蛋白基因显著上调。结论:EF拮抗皮质酮诱导的大鼠肾上腺皮质过度凋亡是其拮抗糖皮质激素对HPA轴的抑制,保护肾上腺皮质功能的机制。     

复方葆春袋泡茶质量标准研究

目的：制订复方葆春袋泡茶质量标准。方法：双波长薄层扫描法测定了五味子乙素的量,对淫羊藿,五味子,女贞子进行了薄层色谱鉴别。结果;加样回收率平均为９７．１５％（ＲＳＤ＝１．２％,ｎ＝５）,标准曲线ｒ＝０．９９９１,重复性ＲＳＤ＝１．４％（ｎ＝６）精密度ＲＳＤ＝２．３％（ｎ＝６）,结论,方法稳定,可靠,可作为该制剂的质量控制方法之一。