MINT蛋白(1-365氨基酸)相互作用分子的筛选

目的 :用酵母双杂交技术筛选与MINT(Msx2 in teractingnucleartargetprotein) F1片段相互作用的分子 ,对MINT转录抑制的机制进行探讨 .方法 :以Mint F1片段 (1～ 36 5氨基酸残基 )连入载体pGBKT7构建的质粒为诱饵 ,利用酵母双杂交技术对人淋巴结cDNA文库进行筛选 ,并分析所获得的阳性克隆 .结果 :从 6× 1 0 7个克隆中共获得 1 2个不重复的阳性克隆 .经序列分析 ,得到 3个有意义的基因 ,分别为人小核RNA 蛋白复合体多肽G(SNRPG)、癌基因Vav和人微球蛋白 1 (MCRS1 ) .结论 :从筛选到的这 3个分子的定位与功能来看 ,MINT分子的N端片段可以与小核RNA 蛋白复合体 (snRNPs) ,Vav,MCRS1和RBP Jκ等相互作用 ,参与细胞内的信号传递 ,调控细胞周期 ,并可能影响RNA的加工与处理     

失血性休克对肠上皮细胞线粒体编码的细胞色素氧化酶mRNA表达变化的研究

目的　观察大鼠失血性休克后肠上皮细胞线粒体编码基因细胞色素氧化酶亚基 (COXⅠ、COXⅡ、COXⅢ )mRNA的表达变化。方法　采用失血性休克模型 ,分离肠上皮细胞后进行RNA的提取 ,应用RT PCR检测COXⅠ、COXⅡ、COXⅢmRNA的表达变化。结果　大鼠失血性休克 1h ,COXⅠ、COXⅡ基因表达开始增强 ,2h表达最强 ,以后随着休克时间延长 ,表达又逐渐减弱 ,失血性休克晚期 5h表达显著低于正常对照组 (P <0 .0 1)。结论　失血性休克可引起大鼠肠上皮细胞线粒体编码基因COXⅠ、COXⅡmRNA的明显改变。     

胞嘧啶脱氨酶基因修饰神经干细胞及其表达的离体实验研究

目的 探讨胞嘧啶脱氨酶(cytimidine deaminase，CD)基因修饰神经干细胞及其基因表达。方法 通过构建真核表达质粒pCMVCD，限制性内切酶消化鉴定后，采用Lipofectamine 2000脂质体介导法转染新生大鼠室管膜下区神经干细胞(Neural stem cells，NSCs)，G418筛选阳性克隆，加入不同浓度的5-氟胞嘧啶(5-Flourocytosine，5-FC)，MTT比色法测定NSCs的生存率。结果 本实验成功地培养并鉴定了神经干细胞，并将CD基因成功地转染了神经干细胞，G418阳性NSCs对低浓度5-FC高度敏感。结论 CD基因修饰神经干细胞的离体实验研究为干细胞治疗研究提供依据。     

sFGFR1基因的克隆与在RTS系统中的高效表达

目的：克隆sFGFRl(soluble fibroblast growth factors receptor-1)基因，并在RTS(rapid translation system)系统中高效表达相应蛋白．方法：培养Swiss rat 3T3 fibroblast细胞株，提取总RNA，用RT—PCR方法获取鼠sFGFR1 cDNA片段，酶切后克隆到pIVEX2．3d载体并进行序列分析；采用Roche RTS ProteinMaster500系统，高效表达sFGFR1蛋白并用Western Blot鉴定表达的蛋白．结果：克隆了sFGFR1基因，测序证实序列正确；Western Blot证实sFGFR1蛋白在RTS系统中高效表达．结论：克隆了sFGFR1基因并在RTS系统获得高效表达．     

人Heparanase基因真核和原核表达载体的构建及融合蛋白的表达

目的：构建人Heparanase基因的真核、原核表达载体，大肠杆菌表达其融合蛋白．方法：采用反转录．聚合酶链反应从人肝癌细胞株HepG2cDNA中，分别扩增出Heparanase编码基因，用限制性内切酶BamHI消化后，插入真核表达载体pcDNA3．1中，经酶切鉴定与测序证实后，连接成包括完整的人Heparanase基因ORF区的真核表达载体，以亚克隆法构建于原核表达载体pRSET的相应酶切位点，转化大肠杆菌BL21菌株，异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生融合蛋白．结果：构建的人Heparanase基因表达载体经序列测定证实，与GenBank登录结果完全一致；双酶切鉴定证实，克隆基因正确插入载体pcDNA3．1及pRSET；SDS-PAGE证实融合蛋白表达成功．结论：成功构建了人Heparanase基因真核、原核表达载体，成功正确表达了6His／Heparanase融合蛋白     

肿瘤坏死因子凋亡相关配体基因的克隆和表达

目的：克隆、表达和鉴定肿瘤坏死因子凋亡相关配体(TRAIL)．方法：从培养的人外周血淋巴细胞中提取总RNA，经RT-PCR获得TRAIL基因．将该基因克隆到pGEM-Teasy载体中，测序鉴定．将TRAIL基因插入pBV220表达载体中，42℃诱导表达4～5h，进行SDS-PAGE分析．免疫印迹法鉴定TRAIL蛋白的表达．结果：DNA测序证明，获得了TRAIL基因，其序列与GenBank中报道序列完全一致．SDSPAGE分析表明，TRAIL蛋白获得高效表达，分子质量为17ku，表达量约占菌体总蛋白的300k，．免疫印迹法鉴定显示，该蛋白可与鼠抗人TRAIL mAb产生阳性反应．结论：成功克隆和表达了TRAIL基因．     

槲皮素对K562/A02细胞株热休克蛋白mRNA及蛋白质表达的影响

目的 了解槲皮素对K562／A02细胞株70kd热休克蛋白(HSP70)基因及蛋白质表达的影响。方法 热处理前后加入终浓度为10μmol／L的槲皮素，RT-PCR方法检测HSP70基因mRNA表达，Western blot方法检测HSP70蛋白表达。结果 热处理明显增加K562／A02细胞HSP70基因mRNA转录和蛋白表达；热处理前加入槲皮素，HSP70基因mRNA及蛋白表达均显著下调；热处理后加入槲皮素，HSP70基因mRNA及蛋白表达无明显变化。结论 热处理能明显增加K562／A02细胞HSP70基因转录和蛋白表达；槲皮素能抑制K562／A02细胞HSP70基因mRNA及蛋白的表达，并且抑制点早于HSP70的基因转录；槲皮素在K562／A02细胞HSP70基因转录启动后则不再有抑制作用。     

ApoE-/-小鼠肾动脉粥样硬化斑块破裂的肾损害

目的 探讨ApoE^-/-小鼠肾动脉粥样硬化斑块破裂对下游肾脏的损伤机制。 方法 采用ApoE^-/-小鼠建立粥样硬化性肾动脉狭窄(ARAS)动物模型。选择肾动脉狭窄程度 <50％的ApoE^-/-小鼠，按斑块分为破裂组和未破裂组；选择同条件喂养的C57BL/6J 野生型小鼠为对照组。常规检测Scr及尿 N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶(NAG)活性；Western印迹检测细胞核中核转录因子κBp65（NF-κBp65）、细胞间黏附分子1（ICAM-1）及P-选择素（P-sel）表达； RT-PCR检测白细胞介素6 （IL-6）mRNA表达；免疫组化染色检测巨噬细胞浸润情况。 结果破裂组Scr和尿NAG活性明显升高（均P < 0.01）；肾组织出现病理改变，肾间质中巨噬细胞浸润增加（P < 0.05）；细胞核中NF-κBp65表达增加（P < 0.05）；ICAM-1、P-sel、IL-6 mRNA表达增加（P < 0.05）。未破裂组上述指标与对照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；肾脏未见明显病理改变。 结论 肾动脉粥样硬化斑块破裂可引起肾脏病理改变和肾功能受损；在粥样硬化性肾动脉狭窄的肾损害机制中，炎性反应是重要因素之一。     

Vascular endothelial growth factor and its receptor expression during the process of fracture healing

Objective： To study the expression regularity of vascular endothelial growth factor （VEGF） during the process of fracture healing, and the type of VEGF receptor expressed in the vascular endothelial cells of the fracture site.
Methods： The fracture model was made in the middle part of left radius in 35 rabbits. The specimens from the fracture site were harvested at 8, 24, 72 hours and 1, 3, 5, 8 weeks, and then fixed, decalcified, and sectioned frozenly to detect the expression of VEGF and its receptor at the fracture site by in situ hybridization and immunochemical assays.
Results： VEGF mRNA and VEGF expression was detected in many kinds of cells at the fracture site during 8 hours to 8 weeks after fracture. Fltl receptor of VEGF was found in the vascular endothelial cells at the fracture site during 8 hours to 8 weeks after fracture, and strong expression of flkl receptor was detected from 3 days to 3 weeks after fracture.
Conclusions： The expression of VEGF and fltl receptor appears during the whole course of fracture healing, especially from 1 to 3 weeks. Flkl receptor is highly expressed in a definite period after fracture. VEGF is proved to be involved in the vascular reconstruction and fracture healing.     

BRMS1在不同转移性乳腺癌细胞中的表达及其与HDAC活性的关系

目的:探讨肿瘤转移抑制基因（BRMS1）在不同转移性乳腺癌细胞中的表达及其与组蛋白去乙酰化酶（HDAC）活性的关系和意义。方法:采用 RT-PCR技术检测3种细胞株〔非转移性MCF-7(A株)，低转移性MDA-MB-453（B株），高转移性MDA-MB-231（C株）〕中BRMS1基因的表达。用Western blot检测在上述3种细胞株中BRMS1蛋白的表达。ELISA检测3种细胞株中HDAC的活性。结果:(1) 在A，B，C 3种细胞株中BRMS1 基因表达依次比例为3.1∶2.0∶1.0。C细胞株比A细胞株BRMS1基因表达降低2.1倍，BRMS1 基因表达随转移程度的增高而明显降低（P＜0. 001)。(2)在A，B，C 3种细胞株中BRMS1蛋白表达依次比例为3.2∶1.9∶1.0。C细胞株比A细胞株BRMS1蛋白表达降低2.2倍，BRMS1随转移程度的增高而明显降低（P＜0. 001)。(3)A，B，C 3种细胞株中HDAC活性依次比例为1.0∶1. 8∶2.6。C细胞株比A细胞株HDAC活性增高1.6倍，随转移程度的增高HDAC活性升高（P＜0. 001)。结论:（1）BRMS1基因和蛋白的表达在3种细胞株中随转移程度的增高而呈递减趋势。（2）HDAC活性在3种细胞株中随转移潜能的增高而呈递增趋势;提示BRMS1可能通过参与调节HDAC活性调控乳腺癌的转移。