Effects of cardiopulmonary bypass on tight junction protein expressions in intestinal mucosa of rats

AIM： To investigate the tight junction protein expressions of intestinal mucosa in an experimental model of cardiopulmonary bypass （CPB） in rats. METHODS： Thirty anesthetized rats were randomly divided into two groups： Group S （n = 10） served as sham operation and group C （n = 20） served as CPB which underwent CPB for 1 h. Expression of occludin and zonula occludens-1 （ZO-1） were determined by Western blotting and immunotochemistry, respectively. Plasma levels of diamine oxidase （DAO） and d-lactate were determined using an enzymatic spectrophotometry. RESULTS： Immunohistochemical localization of occludin and ZO-1 showed disruption of the tight junctions in enterocytes lining villi at the end of CPB and 2 h after CPB. The intensities of the occludin and ZO-i at the end of CPB were lower than those of control group （76.4% ± 22.5% vs 96.5% ± 28.5% and 62.4% ± 10.1% vs 85.5% ±25.6%, P 〈 0.05） and were further lower at 2 h after CPB （50.5% ± 10.5% and 45.3% ± 9.5%, P 〈 0.05）. Plasma d-lactate and DAO levels increased significantly （8.688 ± 0.704 vs 5.745 ± 0.364 and 0.898 ± 0.062 vs 0.562 ± 0.035, P 〈 0.05） at the end of CPB compared with control group and were significantly higher at 2 h after CPB than those at the end of CPB （9.377 ± 0.769 and 1.038 ± 0.252, P 〈 0.05）. There were significant negative correlations between occludin or ZO-1 expression and DAO （r^2 = 0.5629,r^2 = 0.5424, P 〈 0.05） or d-lactate levels （r^2 = 0.6512,r^2 = 0.7073, P 〈 0.05） both at the end of CPB and 2 h after CPB. CONCLUSION： CPB markedly down-regulates the expression of occludin and ZO-1 proteins in intestinal mucosa of rats. The close correlation between expression of tight junctions （TJs） and plasma levels of DAO or d-lactate supports the hypothesis that intestinal permeability increases during and after CPB because of decreases in the expressions of TJs.     

细胞连接调控蛋白在大鼠胰腺癌和非癌胰腺组织中表达及意义

目的：建立SD大鼠胰腺癌模型,研究细胞连接调控蛋白（Claudin-1,Occludin,E-cad,Snail）在胰腺癌发生发展过程中的作用及其意义.方法：90只大鼠随机分为二甲基苯荓蒽（DMBA）组（A组,n=40）,DMBA＋曲古霉素A（TSA）组（B组,n=40）和空白对照组（C组,n=10只）.将DMBA直接置入A,B组胰腺实质内建立胰腺癌模型,B组腹腔注射TSA,～5mo内处死并观察胰腺癌发生情况,C组于第5mo处死.采用En-VisionTM免疫组化法检测Claudin-1,Occludin,E-cad,Snail的表达.结果：A组3～5mo癌发生率为48.6%（18/37）,5mo（60.0%）高于4mo组（40.0%）和3mo组（28.6%）.B组3～5mo癌发生率为33.3%（12/36）,5mo（40.0%）高于4mo组（30.0%）和3mo组（16.7%）.A组发癌率高于B组.A组,B组胰腺导管癌分别为17例和11例,其余为纤维肉瘤;A组胰腺癌最大径均值大于B组（A组：0.5～1.0cm7例,1.0～2.0cm10例,〉2.0cm1例;B组：0.5～1.0cm9例,1.0～2.0cm2例,〉2.0cm1例,P〈0.05）;C组胰腺和A,B,C组胰腺外主要脏器均未见明显病理改变.A组＋B组胰腺导管癌Clau-din-1,Occludin,E-cad表达阳性率明显低于A组＋B组非癌胰腺组织（P〈0.05或P〈0.01）,但Snail则相反（P〈0.01）;在胰腺导管腺癌中Claudin-1,Occludin,E-cad表达均相互呈一致性（P〈0.05或P〈0.01）,但三者均与Snail表达呈明显不一致性（P〈0.05或P〈0.01）.结论：较大剂量DMBA置入胰实质内可在短期内获得较高的SD鼠胰腺癌发生率,TSA能抑制胰腺癌发生和生长;Claudin-1,Occludin,E-cad和Snail在DM-BA诱导SD大鼠胰腺癌发生中可能有重要作用.     

靶向干扰睾丸支持细胞功能的重组避孕疫苗的构建与表达

目的 构建含小鼠卵泡刺激素(亚单位(FSH-β)与闭锁因子(Ocln )特定基因片段的重组质粒,以期获得靶向干扰睾丸支持细胞功能的重组避孕疫苗.方法 运用PCR 技术,分别扩增小鼠FSH-β亚单位特定基因序列和闭锁因子第二个胞外环序列片段;定向克隆到pET28b表达载体中;并运用免疫印迹法对重组蛋白的表达做初步鉴定.结果 通过双酶切分析、测序鉴定证实特定的FSH-β亚单位和Ocln基因片断被成功克隆到pET28b中,且诱导表达的重组蛋白能够被抗小鼠FSH-β及抗O cln抗体所识别.结论 重组分子具有两种靶分子的抗原性,为进一步研究其生物学活性及免疫避孕效应奠定基础.     

葛根芩连汤调控MMP-9/p38 MARK途径修复溃疡性结肠炎小鼠肠黏膜上皮屏障功能

目的 探讨葛根芩连汤对溃疡性结肠炎（UC）小鼠肠黏膜上皮屏障功能的保护作用,并通过基质金属蛋白酶-9（MMP-9）/p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）信号通路探究其治疗UC的作用机制。方法 48只雌性C57BL/6小鼠随机分为正常组、模型组、柳氮磺吡啶组（0.3 g·kg^-1）及葛根芩连汤高、中、低剂量组（2.84,1.42,0.71 g·kg^-1）。采用3%葡聚糖硫酸钠（DSS）溶液构建UC小鼠模型,葛根芩连汤和柳氮磺吡啶于造模后第8天灌胃给药,连续7 d,正常组给予等量生理盐水处理。末次给药后取结肠组织,苏木素-伊红（HE）染色观察结肠组织病理变化,免疫组化（IHC）观察结肠组织紧密连接（TJ）蛋白,如闭合蛋白（Occludin）,闭锁连接蛋白-1（ZO-1）的表达,实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测结肠组织中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）,白细胞介素-1β（IL-1β）,MMP-9 mRNA表达,蛋白免疫印迹法（Western blot）检测结肠组织中磷酸化（p）-p38 MAPK,p38 MAPK和MMP-9蛋白的表达。结果 与正常组比较,模型组小鼠体质量显著下降（P<0.01）,疾病活动指数（DAI）评分显著升高（P<0.01）,结肠黏膜上皮破损并可见黏膜和黏膜下层炎细胞浸润明显,Occludin,ZO-1蛋白表达显著降低（P<0.01）,TNF-α,IL-1β,MMP-9 mRNA相对表达量显著升高（P<0.01）,p-p38 MAPK和MMP-9蛋白表达显著升高（P<0.01）;与模型组比较,柳氮磺吡啶组、葛根芩连汤各剂量组小鼠体质量和DAI评分均有明显改善（P<0.05,P<0.01）,结肠组织损坏明显改善,Occludin,ZO-1蛋白明显增多（P<0.05,P<0.01）,TNF-α,IL-1β,MMP-9 mRNA相对表达量显著下降（P<0.01）,p-p38 MAPK和MMP-9蛋白表达显著下降（P<0.01）,其中葛根芩连汤各组中以中剂量组的变化最为明显。结论 葛根芩连汤能够通过抑制MMP-9和炎性细胞因子TNF-α,IL-1β的表达,阻断p38 MAPK信号通路的激活,增加TJ蛋白的表达,从而修复肠道黏膜屏障功能。     

胆汁外引流对梗阻性黄疸大鼠肠黏膜紧密连接影响的实验研究

目的探讨胆汁在保护小肠黏膜屏障中的作用及其机理。方法 50只Wistar大鼠随机分为对照组(n=10)、梗阻性黄疸(阻黄)组(n=20)及外引流组(n=20)。造模10 d后测定血浆内毒素水平;取末端回肠黏膜组织,光镜下观察黏膜形态改变并测量相关指标,采用免疫组化及Western blot法检测紧密连接相关蛋白(闭锁小带蛋白-1及闭锁蛋白)的表达。结果阻黄组小肠黏膜萎缩明显,其肠绒毛高度、黏膜厚度和隐窝深度与对照组相比分别下降27.8%、21.7%和25.4%(P=0.001、0.001、0.040);外引流组各指标较对照组无明显变化(P=0.050、0.070、0.080),而明显优于阻黄组(均P=0.001)。阻黄组的血浆内毒素水平高达(1.49±0.27)EU/ml,明显高于对照组的(0.27±0.09)EU/ml(P=0.001);外引流组为(0.91±0.25)EU/ml,高于对照组而低于阻黄组(P=0.001)。免疫组化结果显示,闭锁小带蛋白-1的强阳性表达从对照组的7/10例降至阻黄组的6/20例(P=0.040),闭锁蛋白则从8/10例降至7/20例(P=0.020);而外引流组分别为8/20例(P=0.100、0.210)和9/20例(P=0.060、0.200),与前2组相比差异均没有统计学意义。Western blot分析显示,阻黄组闭锁小带蛋白-1和闭锁蛋白的表达水平较之对照组均明显下降(P=0.001、0.010);外引流组高于阻黄组(P=0.005、0.014),而闭锁小带蛋白-1的表达水平低于对照组(P=0.001),闭锁蛋白的表达与对照组比较差异无统计学意义(P=0.062)。结论肠道内胆汁缺乏会破坏肠紧密连接相关蛋白的成分,损伤肠黏膜屏障;胆道梗阻时由于存在其他因素,肠黏膜屏障损伤更严重。胆汁在保护肠黏膜屏障中具有重要作用。     

大鼠局灶性脑缺血再灌注血脑屏障超微结构及紧密连接蛋白Occludin变化的研究

目的研究大鼠局灶性脑缺血再灌注模型血脑屏障(BBB)超微结构和Occludin的变化,探讨BBB的结构改变及Occludin的表达异常在再灌注损伤中的作用。方法雄性Wistar大鼠,随机分成假手术组、缺血2h再灌注3h、12h、24h、72h组,应用透射电镜、RT-PCR、免疫组化和Western Blot等方法观察再灌注后不同时相缺血区皮质BBB的超微结构,Occludin mRNA和蛋白水平的变化。结果局灶性脑缺血再灌注后,缺血区皮质BBB的超微结构受损,Occludin mRNA和蛋白表达水平下调。上述变化开始于再灌注后3h,再灌注24h达到高峰,72h开始减弱。结论脑缺血再灌注过程中,BBB的超微结构损伤及Occludin的表达下降加重了缺血再灌注损伤。     

四君子汤对UC模型大鼠的治疗作用及其对紧密连接蛋白Occludin表达的影响

目的:观察四君子汤对2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的溃疡性结肠炎大鼠治疗作用及其对黏膜上皮细胞紧密连接蛋白闭合蛋白(Occludin)表达的影响。方法:SD大鼠实验分为正常组,模型组,阳性药组(柳氮磺胺吡啶肠溶片,SASP,0.4 g·kg~(-1)),四君子汤高、中、低剂量给药组(生药5.6,2.8,1.4 g·kg~(-1)),每组8只。除正常组外,其余各组采用TNBS灌肠法制作溃疡性结肠炎模型,造模24 h后各组分别按设计剂量连续ig给药10 d。观察大鼠饮食、精神状态、疾病活动指数、大便次数与质量等情况,末次给药24 h后,处死动物取结肠,肉眼观察结肠黏膜的病变并进行结肠大体形态损伤评分,取病变部位进行HE染色,光镜下评价黏膜病理损伤指数,免疫组织化学法检测大鼠结肠Occludin蛋白的表达。结果:模型组大鼠DAI评分、结肠形态与组织学损伤评分等均比正常组高,Occludin蛋白表达较正常组低(P0.05),四君子汤与SASP治疗能不同程度减轻TNBS诱导的UC模型对黏膜的破坏,使紧密连接蛋白Occludin表达升高,抑制结肠通透性的增加,保护结肠黏膜屏障功能(P0.05)。结论:四君子汤能有效增加Occludin蛋白表达,促进实验性UC大鼠结肠黏膜屏障功能修复,这可能是其治疗结肠炎的机制之一。     

The second extracellular loop dictates Occludin-mediated HCV entry

Recent findings have implicated tight junction (TJ) protein Occludin (OCLN) as an essential factor for hepatitis C virus (HCV) to enter human hepatocytes. To gain insights into OCLN-mediated HCV entry, we created a panel of OCLN deletion mutants and found that without impairing OCLN's cell surface localization, removal of the extracellular loop 2 (EL2) from OCLN abolished both its ability to mediate HIV-HCV pseudotypes' (HCVpp) entry as well as its ability to coprecipitate HCV glycoprotein E2. Recombinant OCLN EL2, however, failed to robustly bind soluble E2 (sE2) in pull-down assays. Subsequent studies revealed that OCLN formed complex with Dynamin II, an important GTPase for endocytosis, in an EL2-dependent fashion. HCVpp, as well as cell culture grown HCV (HCVcc), was sensitive to Dynamin knockdown or inhibition. We conclude that OCLN EL2 dictates the Dynamin-dependent HCV entry. Furthermore, OCLN could function to bridge virions to Dynamin-dependent endocytic machineries.     

大鼠Occludin基因克隆及其在肺泡Ⅱ型上皮细胞中的表达

目的 克隆大鼠紧密连接蛋白Occludin基因,构建哺乳动物表达载体.为进一步研究该基因的功能提供手段.方法 采用RT-PCR法克隆大鼠Occludin基编码序列,定向克隆法构建该基因哺乳动物表达载体.脂质体介导该栽体转染人肺泡Ⅱ型上皮A549细胞,Western-blot法检测Oecludin蛋白表达.结成功克隆Occludin基因,构建pCMV-Occ哺乳动物表达载体并在A549细胞中表达.结论 pCMV-Occ载体可介导Occludin基因在人肺Ⅱ型上皮A549细胞表达.