Granulocyte colony-stimulating factor attenuates delayed tPA-induced hemorrhagic transformation in ischemic stroke rats by enhancing angiogenesis and vasculogenesis

Treatment with tissue plasminogen activator (tPA) beyond the therapeutic time window (>4.5 hours post stroke) may produce hemorrhagic transformation (HT). Strategies that could extend the narrow time window of tPA will benefit a significant number of stroke patients. Male Sprague–Dawley rats underwent middle cerebral artery occlusion (MCAo) and given vehicle, tPA (10 mg/kg), or tPA and granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF, 300 μg/kg), at 6 hours after MCAo. Twenty-four hours post treatment, G-CSF+tPA-treated stroke rats displayed 25% improvement in neurological functions and 38.9% reduction of hemorrhage, with Western blots showing 1.9- and 1.2-fold increments in Ang-2 expression in the ischemic cortex and striatum, respectively, and 3-fold increase in phosphorylated endothelial nitric oxide synthase expression in the ipsilateral cortex relative to tPA-treated rats. Immunohistochemistry also showed 2- and 2.8-fold increase in von-Willebrand expression, 3.2- and 2.2-fold increased CD34+ expression, and 4- and 13-fold upregulation of VEGFR-2 expression in the ischemic cortex and striatum, respectively, in G-CSF+tPA-treated stroke rats relative to tPA-treated subjects. Altogether, these findings indicate that G-CSF attenuated delayed tPA-induced HT likely via the enhancement of angiogenesis and vasculogenesis. The use of G-CSF to protect the vasculature may improve the clinical outcome of tPA even outside the currently indicated therapeutic window for ischemic stroke.     

糖尿病患者外周血内皮祖细胞的相关影响因素研究

目的：探讨2型糖尿病患者外周血循环中内皮祖细胞（EPCs）与丙二醛（MDA）、游离脂肪酸（FFA）及细胞间黏附分子-1（CAM-1）的相关性。方法采集2型糖尿病患者（糖尿病组,48例）及非糖尿病患者（对照组,48例）静脉血,采用流式细胞仪计数外周血循环 EPCs 表面标志物（CD133、CD34、VEGFR-2）的表达,分别采用分光光度计检测 FFA 浓度,用酶标仪检测 MDA 浓度,用 ELISA 法检测 CAM-1浓度。结果（1）两组受试者的MDA、CD133差异均无统计学意义（P ＞0．05）;糖尿病组高密度脂蛋白胆固醇、VEGFR-2、CD34均低于对照组,差异有统计学意义（P ＜0．05）;糖尿病组体质指数、收缩压、CAM-1、FFA 均高于对照组,差异有统计学意义（P ＜0．05）。（2）糖尿病患者 FFA 与 CD34及 VEGFR-2数量呈负相关（r ＝-0．552,P ＝0．001;r ＝-0．342,P ＝0．022）,MDA 与 CAM-1无相关性。结论糖尿病患者 EPCs 数量低于非糖尿病对照者,尤其以晚期 EPCs（VEG-FR2、CD34）数量减少更突出。FFA 浓度与糖尿病患者晚期 EPCs 数量呈负相关,MDA、CAM-1没有显示出与糖尿病患者 EPCs 数量的相关性。     

大鼠骨髓源性血管内皮祖细胞体外培养分化及鉴定

目的：探索大鼠骨髓源性血管内皮祖细胞（EPCs）的培养、诱导分化及鉴定方法。方法：冲洗大鼠骨髓腔,梯度密度离心法获得单个核细胞,内皮细胞培养液EGM-2MV培养,通过细胞形态,免疫组化和免疫荧光检测CD34、VEGFR-2、vWF,CD133,摄取Dil-ac-LDL和结合FITC-Lectin-UEA-1,超微结构及染色体核型分析进行鉴定。结果：新分离的骨髓单个核细胞呈圆形,大小不一;48h后部分细胞开始贴壁,呈梭形、纺锤形或不规则形;4～8d呈细胞集落或线状排列;9～11d接近融合,呈典型鹅卵石样外观。贴壁细胞CD34、CD31、VEGFR-2、vWF、CD133均表达阳性并呈动态变化,能够摄取Dil-ac-LDL和结合FITC-Lectin-UEA-1,透射电镜见特征性Weible-Palade小体,能稳定保持二倍体核型。结论：本实验初步建立了一套大鼠骨髓血管内皮祖细胞分离、培养、诱导分化及鉴定方法体系。     

Tissue plasminogen activator enhances mobilization of endothelial progenitor cells and angiogenesis in murine limb ischemia

Background

It has been reported that plasmin induces migration of endothelial cells. We hypothesized that tissue plasminogen activator (tPA) enhanced endothelial progenitor cell (EPC) mobilization from bone marrow (BM) into the circulation and angiogenesis in murine critical limb ischemia (CLI).

Methods

Forty male B6 mice were randomly divided into group 1 (control), group 2 [control + recombinant tPA (intra-venous 4 mg/kg)], group 3 (CLI) and group 4 (CLI + tPA).

Results

The results demonstrated higher MMP-9 activity in BM and circulatory SDF-1α level in groups 2 and 3 than in group 1, and highest in group 4 (all p < 0.01) at 18 h after CLI. Compared with circulation, SDF-1α level in BM showed an opposite trend (all p < 0.03). The circulating EPC (C-kit/CD31, Sca-1/KDR, CXCR4/CD34) levels at 18 h after CLI were higher in group 2 than in groups 1 and 3, and highest in group 4 (all p < 0.03). EPC (C-kit/CD31, Sca-1/KDR) levels in BM were lower in group 1 than in groups 2 to 4 (all p < 0.03), whereas number of CXCR4/CD34-positive EPCs in BM did not differ among the four groups at 18 h after CLI. Protein expressions of SDF-1α, CXCR4, eNOS, and VEGF, numbers of CD31+, CXCR4+, SDF-1α+, and vWF + cells through immunofluorescent staining, numbers of small vessels (< 15 μm) and blood flow measured by Laser Doppler in an ischemic area were significantly higher in group 4 than in group 3 (all p < 0.005) at day 14 after CLI.

Conclusion

tPA treatment enhanced number of circulating EPCs, angiogenesis, and blood flow to ischemic tissue in a murine model of limb ischemia.     

内皮祖细胞捕获支架防治犬肝静脉再狭窄的实验研究

目的观察内皮祖细胞（Endothelialprogenitorcells,EPCs）捕获支架置入预防犬肝静脉支架内再狭窄的效果。方法家犬24只,按随机数字表法分为实验组与对照组,每组12只,每组再分为2个亚组各6只。实验组置入EPCs捕获支架,对照组直接置入支架。术后第1周每组处死一个亚组动物,取部分支架内组织用于扫描电子显微镜观察。术后第8周行肝静脉造影复查,处死剩余动物,然后取支架内及邻近支架肝静脉血管组织织用于光学显微镜观察。结果术后第1周,通扫描电子显微镜观察支架腔面内皮化程度实验组明显优于对照组。术后第8周肝静脉造影复查,实验组支架开放情况明显优于对照组（t=20,P〈0.01）;光学显微镜观察实验组平均新生内膜厚度、平均新生内膜面积、平均百分狭窄面积均显著优于对照组（t值分别为6.08、4.50和5.52,P〈0.01）。结论 EPCs捕获支架可以促进肝静脉支架腔面的血管内皮生长,预防再狭窄。     

葛根素对外周血内皮祖细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

目的：研究葛根素对外周血内皮祖细胞（EPCs）缺氧/复氧损伤的保护作用。方法：采用密度梯度离心法和贴壁培养法相结合,使用专用培养基EGM-2,成功分离纯化EPCs,通过形态学、细胞表面分子标志物检测、内皮祖细胞吞噬功能对其鉴定;采用Krebs液建立缺氧/复氧损伤模型,用葛根素干预后,采用MTT法测定细胞活力、2,4-二硝基苯肼显色法测定细胞外乳酸脱氢酶（LDH）释放量、黄嘌呤氧化酶法测定细胞内超氧化物歧化酶（SOD）活性、硫代巴比妥酸法测定丙二醛（MDA）含量、硝酸还原酶法测定一氧化氮（NO）含量;Western blot法考察胞核、胞质Nrf2和全细胞HO-1蛋白表达。结果：与模型组相比,葛根素20.8 mg·L^-1及41.6 mg·L^-1组显著提高细胞活力（P<0.05,P<0.01）;葛根素20.8 mg·L^-1及41.6 mg·L^-1能显著降低NO、MDA含量和LDH释放量（P<0.01）;葛根素20.8 mg·L^-1,41.6 mg·L^-1,83.2 mg·L^-1均显著提高缺氧/复氧后细胞SOD活性（P<0.01）,并上调细胞HO-1、胞核Nrf2蛋白表达（P<0.01）,显著降低胞浆Nrf2蛋白表达（P<0.01）。结论：葛根素可显著拮抗缺氧/复氧对EPCs的损伤,可能与其抑制细胞过氧化损伤,增强细胞抗氧化能力有关。     

内皮祖细胞在肝细胞癌患者外周血中的生物学行为

目的：探讨肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma,HCC）患者外周血中的内皮祖细胞（endothelial progeni-tor cells,EPCs）的生物学行为,以了解其在HCC侵袭和转移中所起的作用。方法：以40例肝癌患者和28例健康对照组为研究对象,流式计量外周血CD133＋/CD34＋双阳性细胞。并同时分离培养EPCs,7天后通过MTT法检测其增殖能力,Transwell法检测细胞迁移能力（即侵袭能力）,细胞体外小管形成实验检测细胞血管形成能力。结果：HCC患者外周血中EPCs增加,并且他们外周血中的EPCs的增殖能力、侵袭能力及体外血管生成能力均高于健康对照组（P〈0.05）。结论：内皮祖细胞可能在肝癌的生长和侵袭过程中起到了重要作用。     

丹酚酸B预处理EPCs对AMI大鼠移植骨髓间充质干细胞后心肌微环境的影响

[目的]探讨中药丹酚酸B预处理的内皮祖细胞(EPCs)对急性心肌梗死(AMI)大鼠移植骨髓间充质干细胞(BMSCs)后心肌微环境的影响。[方法]56只AM I模型大鼠随机分为假手术组、模型组、BM SCs组、EPCs+BM SCs组,其中治疗组用丹酚酸B最佳药物浓度处理的EPCs与BM SCs混合,在大鼠AM I区周边分5点注射。免疫荧光和免疫组化方法检测AM I大鼠梗死区心肌收缩蛋白α型肌球蛋白重链(α-M H C)和I型胶原蛋白的表达。[结果]细胞移植4周后,各细胞联合移植组中,2∶14、∶1和8∶1组在Brdu集中表达区域均有不同强弱程度的α-MHC阳性表达,除假手术组较少外,所有接受冠状动脉结扎的大鼠心肌梗死区I型胶原表达均升高。[结论]BMSCs在丹酚酸B预处理的EPCs干预的心肌微环境下可向心肌细胞分化,可预防或改善心室重塑的发生。     

电针介导eNOS动员内源性EPCs促MCAO/R大鼠脑内血管再生

目的 探讨内皮型一氧化氮合酶（eNOS）在电针干预下对局灶脑缺血/再灌注大鼠骨髓及外周血中内皮祖细胞（EPCs）数量变化的影响,及其促大鼠脑内血管再生的机制。方法 线栓法制备大鼠局灶脑缺血/再灌注模型,选择“百会”穴及左侧“四关”穴为针刺穴位,刺激时间为20 min,每日1次。100只SD雄性大鼠随机分为正常组（N组）、模型组（I/R组）、模型 电针组（I/RE组）、模型 电针 L-NAME组（I/REL组）。除N组外的各组局灶脑缺血1.5h后分为再灌注1d、2d、7d三个亚组,每个亚组10只大鼠。在各时间点采用流式细胞术检测外周血及骨髓中VEGFR2 EPCs数量,荧光定量PCR技术检测缺血脑区VEGFR2 mRNA的表达,免疫组化法检测缺血大脑皮质CD34标记的微血管的计数。结果 与I/R组比较,电针可明显提高骨髓及外周血中EPCs的数量（P＜0.01,P＜0.05）,而I/REL组的VEGFR2 EPCs数量相比于I/RE组则显著降低（P＜0.01）。各时间点I/RE组缺血大脑皮质区VEGFR2 mRNA及CD34血管计数明显高于I/R组（P＜0.01）,而I/REL组与之比较则显著减少（P＜0.01）。结论 电针可动员局灶脑缺血/再灌注大鼠内源性EPCs促大鼠缺血脑区血管再生,该作用在eNOS被抑制后减弱,推测电针动员EPCs促血管再生的作用与eNOS的激活有关。