中外七个贾第虫株DNA限制性酶切片段长度多态性（RFLP）比较研究

本文首次对分离自中国、美国、柬埔寨和澳大利亚７株贾第虫基因组ＤＮＡ，用６种限制性内切酶消化并进行琼脂糖电泳，分析比较它们基因组ＤＮＡ酶切片段多态性；同时用生物素标记的贾第虫全基因组ＤＮＡ探针对国内４株贾第虫ＤＮＡ进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交。结果表明，７株贾第虫ＤＮＡ经ＨｉｎｄⅢ和ＢｇｌⅡ酶切后，可将国内４株和国外３株贾第虫区别开；国内４株贾第虫ＨｉｎｄⅢ、ＢｇｌⅢ、ＨａｅⅢ、ＰｓｔⅠ和Ｈｉｎｆ５种内切酶酶切图谱一致；而经ＡｌｕＩ酶切后，Ｃ１和ＣＲ的ＤＮＡ图谱一致，Ｃ２和Ｃ３的也一致；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交显示，国内４株间的ＤＮＡ杂交带相似，提示分离自人和兔的贾第虫无严格的宿主专一性，二者可产生交叉感染；国内３株与国外２株人贾第虫ＤＮＡ图谱存在差异，其原因似与地理隔离有关。     

十二指肠贾第虫Rab11互作蛋白的筛选

目的 Rab11属于Rab小分子GTP酶家族,主要参与贾第虫外泌体样囊泡的产生。研究贾第虫囊泡运输中的分子机制,探寻贾第虫Rab11蛋白的互作蛋白至关重要。方法 通过分子克隆技术构建含His标签的原核表达质粒pET-32a-Rab11,经诱导表达和纯化,获得Rab11融合蛋白(rGdRab11)。用该蛋白免疫小鼠,制备抗血清,以此为抗体采用免疫荧光法观察Rab11蛋白的亚细胞定位。应用His-pull down联合质谱技术筛选贾第虫全虫蛋白中与Rab11蛋白互作的候选蛋白,并在GiardiaDB数据库和Revigo中对筛选的候选蛋白进行生物信息学分析。结果 成功表达和纯化出Rab11融合蛋白,并制备鼠源抗Rab11多克隆抗体。免疫荧光法观察Rab11蛋白定位于贾第虫滋养体细胞膜区域和细胞质中。共筛选出528个与Rab11特异性结合的候选互作蛋白,其中蛋白质评分大于20分的候选互作蛋白有517个,包括124个未知蛋白,393个已知蛋白。GO分析上述蛋白涉及组蛋白修饰、组蛋白单泛素化、代谢过程、建立或维持细胞骨架极性以及内吞等多种生物进程。结论 成功表达和纯化出Rab11融合蛋白,并制备了...     

基于磷酸丙糖异构酶基因序列的蓝氏贾第鞭毛虫分子系统发育的研究

[目的 ]探讨蓝氏贾第鞭毛虫种内系统发育及遗传多样性。 [方法 ]对不同来源虫株的磷酸丙糖异构酶(tim)基因进行 PCR扩增、序列测定后 ,用简约法和 NJ法构建分子系统树进行系统学分析。 [结果 ]在所测序列中共有 12 4个位点存在变异 (2 3% ) ,且大多数为发生在第三密码子的同义突变 ,两种构树方法所得两树的分枝结构相似 ,均将受试的 16株蓝氏贾第鞭毛虫分为明显的两组。 [结论 ]tim基因可作为研究蓝氏贾第鞭毛虫群体遗传结构一个有效的遗传标记     

蓝氏贾第鞭毛虫C2株rRNA基因ITS1-5.8SrDNA-ITS2序列测定与分析

内转录间隔区（internal transcribed spacer ITS）为真核生物rRNA基因（rDNA）中串联重复存在的大小亚基间的内转录间隔序列.研究表明,贾第虫rDNA包含18S、5.8S和23SrDNA,3者的内转录间隔区为ITS-1和ITS-2,前者位于18S和5.8SrDNA之间,后者位于5.8SrDNA和23SrDNA间.18S、5.8S和23SrDNA序列较保守,进化速率较慢,不同种生物间同源性较大;而ITS序列并不保守,进化速率较快,种间同源性较小,是鉴定生物种株的一个十分有效的分子标志.研究表明,不同宿主和不同地域来源的蓝氏贾第虫虫株存在遗传学差异.     

C2株蓝氏贾第鞭毛虫TCTP基因的克隆、表达和序列分析

目的克隆C2株蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia,简称贾第虫)的翻译调控肿瘤蛋白(Translationally controlled tumor protein,TCTP)编码区,对其进行生物信息学分析和原核表达。方法根据WB株贾第虫TCTP编码区序列设计引物,以C2株贾第虫基因组DNA为模板扩增获得TCTP编码区片段,双酶切连入原核表达载体pET-28a(+),将酶切和测序验证正确的重组质粒转化E. coli Rosetta(DE3),经IPTG诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE及Western blot鉴定蛋白产物,采用Ni-NTA经亲和层析纯化重组蛋白。同时根据测序结果分析C2株贾第虫TCTP蛋白结构特征和进化关系。结果克隆了包含酶切位点全长470 bp的C2株贾第虫TCTP编码区,构建了原核表达载体pET-28a(+)-TCTP,在Rosetta(DE3)中表达、纯化得到了相对分子量约18.5 kDa的融合蛋白,与预期相符;测序结果显示C2株贾第虫TCTP序列与WB株相同,生物信息学分析显示贾第虫TCTP蛋白虽然序列长度较其它物种更短但与裂殖酵母TCTP空间结构相似,均由4个β折叠和3个主要的α螺旋组成,位于序列中部的不规则环状结构更小,仅9个氨基酸残基组成,在进化上与其它真核生物亲缘关系较远。结论成功克隆表达了贾第虫TCTP,为TCTP功能及贾第虫致病机制的研究提供了实验依据。     

C2株蓝氏贾第鞭毛虫SUMO特异性蛋白酶基因的克隆、生物信息学分析及其催化活性区的原核表达

目的 克隆C2株蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia,简称贾第虫)的SUMO-Specific Protease(SENP)基因,并对其序列进行生物信息学分析,原核表达贾第虫SENP的催化活性区。方法 提取C2株贾第虫基因组DNA,以基因组DNA为模板获得SENP编码区全长片段,连入克隆载体pGM-T,测序后进行生物信息学分析;根据分析结果克隆SENP的催化活性区,构建其原核表达载体pET-28a(+)-SENPc,在E.coli Rosetta(DE3)中诱导表达,SDS-PAGE及Western blot观察表达结果。结果 成功克隆了C2株贾第虫SENP编码区全长序列,生物信息学分析显示C2株贾第虫SENP蛋白序列与WB株相同,二级结构以无规则卷曲为主,其催化活性区位于126-497aa,被一段插入序列分割成两个部分;构建了SENP催化活性区原核表达载体并在大肠杆菌中高效表达,在相对分子量约43 kD的位置出现目的 蛋白条带,与理论值相符。结论 成功克隆了贾第虫SENP基因并原核表达了其催化活性区,为贾第虫SENP蛋白功能的研究提供了基础。     

姜春华治疗慢性肾炎的经验

姜春华老师治疗慢性肾炎,以中医辨证为主,参考实验室指标,病证结合,揆度邪正,创用新法,巧裁效方,疗效显著。现整理其治法5则,并附验案,以公同好。     

志谢

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C2株蓝氏贾第鞭毛虫组蛋白H3基因的克隆表达与基因分析

目的 克隆表达C2株蓝氏贾第鞭毛虫H3组蛋白基因,与WB株蓝氏贾第鞭毛虫进行同源分析,构建C2株蓝氏贾第鞭毛虫H3组蛋白分子进化树。方法 PCR扩增获取H3组蛋白基因,构建pGM-T-H3重组载体,转化E. coli TOP10感受态宿主细胞,挑选阳性克隆并进行序列分析,利用限制性内切酶NcoⅠ和 XhoⅠ构建pET28a(+)-H3重组载体,转化E. coli Rosetta( DE3),IPTG诱导组蛋白H3表达,Western blotting鉴定表达,与美国WB株蓝氏贾第鞭毛虫及模式生物H3组蛋白基因和蛋白序列进行同源分析。结果 成功克隆表达C2株蓝氏贾第鞭毛虫H3组蛋白基因,同源比对结果显示C2株蓝氏贾第鞭毛虫基因序列与美国WB株完全一致,但与其他现存真核生物亲缘关系较为疏远。结论 C2株蓝氏贾第鞭毛虫H3组蛋白分子进化树分析表明贾第虫H3组蛋白基因在进化过程中与其他物种分化较早,本研究结果为进一步研究蓝氏贾第鞭毛虫的生物进化地位提供有价值的实验资料。     

蓝氏贾第鞭毛虫的免疫逃避机制

蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia,简称贾第虫)是一种世界性分布的机会性致病原虫,能够引起以腹泻为主要表现的贾第虫病,严重影响人类尤其是儿童的健康和发育。在贾第虫感染过程中,宿主的非特异性和特异性免疫系统均会产生强烈的抗贾第虫效应,但贾第虫通过抗原漂变、L-精氨酸饥饿等机制逃避和抑制宿主的免疫反应,引起宿主的长期或反复感染。本文对宿主的抗贾第虫免疫以及贾第虫的免疫逃避机制做一综述。