高糖条件下人视网膜色素上皮细胞的上皮-间质转化

背景 研究证实,有多种细胞参与增生性玻璃体视网膜病变(PVR)的发生和发展过程,其中RPE细胞的上皮-间质转化(EMT)可能与PVR有关,其主要生物学行为是RPE细胞的增生和迁移.已证实高血糖是糖尿病视网膜病变(DR)发病的主要原因,而高糖条件下RPE细胞是否发生EMT鲜有报道. 目的 建立体外高糖细胞培养模型,探讨高糖对人RPE的迁移能力及EMT的影响.方法 用含质量分数10％胎牛血清的DMEM/F12培养基对人RPE细胞D407细胞株进行体外培养和传代,取6～8代细胞用于实验.依据培养液中血糖浓度的不同将细胞分为3个组,正常对照组培养基中葡萄糖终浓度为5.5 mmol/L,高糖培养组葡萄糖终浓度为60.0 mmol/L,用含5.5 mmol/L葡萄糖和甘露醇的DMEM培养基培养细胞作为高渗对照组.采用细胞划痕试验法检测划痕后0、24、48和72 h时3个组RPE细胞的迁移率,用实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测高糖培养组在培养不同时间点RPE细胞间质化标志物闭锁小带蛋白-1(ZO-1)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)mRNA在细胞中的相对表达水平.结果 正常对照组培养的RPE细胞呈多角形,核仁清晰,排列致密;高糖培养组随着培养时间的延长,RPE细胞逐渐变大、变长,细胞结构不清,排列紊乱;高渗对照组细胞结构接近正常对照组.划痕试验显示,高糖培养组在划痕后48 h可见细胞迁移,划痕后72 h划痕基本消失,而正常对照组和高渗对照组划痕仍然存在.划痕后各时间点高糖培养组细胞迁移率明显高于正常对照组和高渗对照组,组间和各时间点的差异均有统计学意义(F分组=328.600,P=0.000;F时间=773.270,P=0.000).RT-PCR结果显示,与正常对照组相比,高糖培养后48 h、72 h组细胞中ZO-1 mRNA的表达水平明显低于正常对照组,而α-SMA mRNA的表达水平明显高于正常对照组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 高糖条件下RPE细胞的迁移能力增强,发生EMT改变,可能参与增生性糖尿病视网膜病变(PDR)的发生.     

PI3K/Akt信号通路介导的胰岛素促RPE细胞增生及分泌转化生长因子β2作用

背景 胰岛素具有促进近视发生的作用,胰岛素受体已被证实存在于视网膜色素上皮(RPE)细胞上,转化生长因子β2(TGF-β2)是RPE细胞分泌的重要的近视信号因子之一.目的 研究胰岛素是否通过磷脂酰肌醇-3-羟基酶/苏氨酸激酶(PI3K/Akt)通路促进RPE细胞增生及分泌TGF-β2.方法 使用含质量分数10％胎牛血清的DMEM培养基常规培养人RPE细胞株ARPE-19细胞,分别将10×103 U(商品单位)/ml胰岛素、LY294002、10× 103 U/ml胰岛素+LY294002、Wortmanin和10× 103 U/ml胰岛素+Wortmanin20 μmol/L各20μl加入培养基,另设常规培养的细胞作为空白对照.作用后48 h,采用MTS法检测各组RPE细胞的增生情况,采用ELISA法检测各组RPE细胞上清液中TGF-β2质量浓度,以评估细胞分泌TGF-β2的能力;各种药物作用后1h和2h,采用逆转录PCR(RT-PCR)法检测各组细胞中TGF-β2mRNA的相对表达量.结果 MTS结果显示,胰岛素+LY294002组RPE细胞的增生值(A值)明显低于胰岛素组(0.75±0.03 versus0.98±0.04),差异有统计学意义(P＜0.05),而胰岛素+Wortmanin组RPE细胞增生与胰岛素组相比,差异无统计学意义(0.97±0.07 versus 0.98±0.04,P＞0.05).ELISA法检测结果显示,胰岛素+LY294002组和胰岛素+Wortmanin组RPE细胞上清液中TGF-β2质量浓度分别为(11.59±2.85)pg/ml和(49.16±10.94) pg/ml,明显低于胰岛素组的(548.50±35.18) pg/ml,差异均有统计学意义(P＜0.05),且胰岛素+LY294002组细胞上清液中TGF-β2质量浓度的下降值明显高于胰岛素+Wortmanin组,差异有统计学意义(t=8.131,P=0.000).RT-PCR结果显示,药物作用后1h和2h,胰岛素+LY294002组和胰岛素+Wortmanin组细胞中TGF-β2mRNA的相对表达量均明显低于胰岛素组,差异均有统计学意义(P＜0.05),胰岛素+ LY294002组细胞中TGF-β2mRNA相对表达量的下降程度稍大于胰岛素+Wortmanin组,作用后1h差异有统计学意义(t=4.176,P=0.014),但作用后2h差异无统计学意义(t=0.756,P=0.492).结论 胰岛素可以通过PI3 K/Akt途径促进RPE细胞增生,并促进RPE细胞分泌TGF-β2以进行信号传递,可能是胰岛素促进近视发生的机制之一.     

血管紧张素Ⅱ对体外培养的牛眼小梁细胞微管及微丝动力学影响的研究

目的 研究血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ,AngⅡ)对体外培养的牛眼小梁细胞骨架的动力学影响,探讨AngⅡ对房水的调节作用及在青光眼发病机制中的意义。方法 （1）牛眼小梁细胞的体外培养,应用免疫组化方法（NSE,Ⅷ因子相关抗原染色）细胞鉴定,光学及电子透射显微镜对细胞进行形态学及生长特性的观察;（2）以含不同浓度AngⅡ-的培养液孵育小梁细胞12-24h,（终浓度分别是10^-5、10^-6、10^-7mol.L^-1)。免疫组化法（SABC）对α-smooth-actin、tubulin-α染色,结果以计算机图像分析系统分析,并统计学检验。结果 牛眼小梁细胞培养成功,成活率80%——100%,上皮型为主,AngⅡ产生明显的细胞收缩效应,actin是收缩的主要效应器。结论 体外培养牛眼小梁细胞技术是研究小梁细胞特性的重要实验技术,AngⅡ可以引起小梁细胞的浓度依赖性的收缩,提示Ang可能是房水排出途径的调节姻子之一,对眼压及青光眼的发生发展有一定的影响。     

人晶体上皮细胞的体外培养

目的:提供一种简单可行,易于掌握的体外培养人晶体上皮细胞的方法。方法:用无齿显微镊子将晶体囊膜分离出来,剪碎后直接移至细胞培养瓶中培养,当细胞长出融合后,用胰蛋白酶消化传代。结果:接种培养4天后,可见晶体上皮细胞开始长出,并以贴壁方式生长。结论:用此方法体外培养人晶体上皮细胞,具有简单、快捷、成功率高的优点。眼科学报1997;13:170—172。     

猪视网膜色素上皮细胞的体外培养与鉴定

目的建立猪视网膜色素上皮（RPE）细胞体外分离、纯化培养体系并进行鉴定,为研究RPE细胞的功能及治疗相关眼底疾病提供细胞来源。方法采用胰蛋白酶消化法获取猪RPE细胞进行原代及传代培养,倒置显微镜观察细胞生长过程及形态变化并计算生长数据,角蛋白和RPE65蛋白抗体免疫细胞化学染色鉴定细胞。结果用胰蛋白酶消化法分离培养的猪RPE细胞生长良好,表现为多边形和梭形两种形态,原代细胞胞浆内含有丰富的色素颗粒,传代细胞内色素颗粒较原代细胞少。免疫组织化学法证实RPE细胞均为鼠抗人角蛋白染色阳性。结论培养的细胞可作为体外猪RPE细胞的来源,体外分离、纯化和培养猪RPE细胞的成功,为RPE细胞功能和相关视网膜疾病的深入研究提供了细胞来源。     

verteporfin光动力疗法对体外培养的成人视网膜色素上皮细胞色素上皮衍生因子、血管内皮生长因子表达水平的影响

目的 观察经光敏剂verteporfin光动力疗法（PDT）处理后的体外培养的成人视网膜色素上皮（RPE）细胞色素上皮衍生因子（PEDF）、血管内皮生长因子（VEGF）mRNA表达水平的改变。 方法 采用噻唑蓝比色法（MTT）测定PDT前后体外培养的成人RPE细胞活性的变化。应用半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)测定PDT前后RPE细胞PEDF和VEGF mRNA表达水平的变化。 结果 PDT可造成RPE细胞死亡，死亡率与激光能量密度和光敏剂浓度成正相关。PDT后RPE细胞表达PEDF、VEGF mRNA水平下降，下降程度与激光能量密度和光敏剂浓度成正相关。 结论 PDT可下调体外培养的成人RPE细胞PEDF、VEGF mRNA的表达水平，这可能与PDT治疗黄斑下脉络膜新生血管膜（CNVM）后CNVM的消退或再生有关。 (中华眼底病杂志, 2006, 22: 256-260)     

兔虹膜和视网膜色素上皮细胞的体外培养比较

目的 观察比较有色素兔虹膜色素上皮(IPE)及视网膜色素上皮(RPE)细胞的体外生长状况。方法 采用酶消化法及酶辅助机械分离法分别分离IPE和RPE细胞。观察培养的两种细胞的生长状况，并对其进行免疫组化鉴定。结果 原代IPE及RPE细胞大多呈圆形或六边形，细胞内充满了黑色素颗粒。随着传代的增加，呈梭形或纤维细胞样生长的细胞增多，细胞中的色素颗粒也逐渐减少。细胞角蛋白免疫组化染色显示IPE及RPE细胞绝大多数呈棕黄色阳性反应。Desmin兔疫组化染色显示IPE细胞中阳性细胞约占5％。结论 分离培养的IPE和RPE细胞纯度很高。IPE细胞中绝大多数为后层IPE细胞。IPE和RPE细胞的形态及体外生长特点类似。     

生长因子FGF在颅缝细胞培养中作用的研究

目的:研究生长因子FGF在颅缝闭合中的调控作用.方法:以颅缝早闭动物模型(SD鼠)的颅缝为研究模型,采用细胞生物学技术、组织化学技术,研究颅缝闭合期间,生长因子bFGF作用下,细胞胶原及骨钙素分泌情况;观察生长因子bFGF,对分离培养的颅缝细胞增殖与代谢影响.结果:在大鼠颅缝分离培养细胞中,bFGF促进颅缝分离培养细胞分泌胶原、骨钙素,加快细胞增殖生长曲线平台期出现,并有效促进大鼠颅缝分离培养细胞S期增殖(p＜0.05).结论:在体外器官培养中,bFGF能促进大鼠分离培养颅缝细胞的活性(p＜0.05).     

兔阴茎海绵体平滑肌细胞的体外培养及其生物学特性

目的 :研究体外培养的新西兰白兔阴茎海绵体平滑肌细胞的生物学特性。　方法 :采用组织块培养法 ,对兔阴茎海绵体平滑肌细胞进行活细胞观察 ,并测定其细胞生长曲线、贴壁率、细胞分裂指数。　结果 :①兔阴茎海绵体平滑肌细胞为梭形 ,呈长轴平行排列 ,具有明显的方向性 ;②体外贴壁快 ,生长迅速 ,体外培养的阴茎海绵体平滑肌细胞在合适的传代条件和比例下能够生存并保持其稳定的生物学特性。　结论 :体外培养的兔阴茎海绵体平滑肌细胞模型可用于检测某些药物对阴茎勃起的影响。     

不同代数软骨细胞及其在支架上的生物学特性

目的 观察不同代数软骨细胞及其在支架上的生物学特性，为软骨组织工程提供理想的种子细胞，方法 将2周齿的新西兰大白兔软骨细胞置盖玻片上进行原代和传代培养，同时，把相应代数的软骨细胞种植于明胶海绵上，应用倒置显微镜和电镜观察不同代数细胞形态学变化和增殖能力。以及不同代数软骨细胞种植于支架后的生长和黏附情况，应用HE染色鉴别及免疫组化观察Ⅱ型胶原的分泌情况。结果 （1）软骨细胞在体外单层培养，传5代后细胞形态由多角形变成梭形，逐渐丧失表型。（2）第4代软骨细胞在单层培养时，增殖能力最强，分泌功能旺盛。（3）传代细胞贴壁时间短于原代。（4）第4代软骨细胞种植于支架上形成软骨细胞-支架复合体所需的时间最短，软骨细胞于海绵支架上的黏附最紧密。结论 软骨细胞在体外培养第4代左右可以作为组织工程的最佳种子细胞，其形成的软骨细胞-支架复合体的质量最佳，时间最短。