诱导型成骨细胞特异Stat3基因敲除小鼠的构建及验证

目的：运用Cre-Loxp基因敲除系统,构建诱导型条件性Stat3基因敲除小鼠并验证其敲除效率。方法：通过Stat3^fl/fl与Col1 creERT2基因型的C57小鼠多代杂交,构建诱导型成骨细胞特异Stat3敲除小鼠Stat3^Col1ERT2。取其骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells, BMSCs）,加入4-羟基他莫西芬（4-OTH）后,采用实时定量PCR技术和免疫印迹技术在mRNA与蛋白水平分别体外验证Stat3敲除效果。于小鼠腹腔注射他莫昔芬,采用免疫荧光染色技术,观察小鼠上颌牙槽骨区域STAT3的表达,以体内验证敲除效果。采用SPSS 24.0软件包对数据进行统计学分析。结果：实时定量PCR和免疫印迹结果显示,Stat3^Col1ERT2小鼠BMSCs体外加药诱导敲除后,STAT3的mRNA水平显著下调（P<0.05）、蛋白表达降低（P<0.05）。免疫荧光染色结果显示,Stat3^Col1ERT2小鼠体内上颌牙槽骨区域成骨细胞的STAT3表达显著降低（P<0.05）。结论：本研究成功构建了诱导型成骨细胞特异Stat3基因敲除小鼠,使基因敲除可受观察者时空调控,为今后正畸牙移动、颌骨牵引成骨、颌骨骨折等牙槽骨改建机制的研究提供了新的思路及依据。     

环状RNA在骨质疏松症中的作用及机制研究进展

随着人口老龄化程度的加剧,老年人骨质疏松症患病率逐年升高,骨质疏松症已成为全世界面临的重要公共卫生问题之一。近年来临床对骨质疏松症的研究多集中于成骨细胞、破骨细胞方面,而对其机制研究甚少。环状RNA是一种新型的稳定的非编码RNA,已有不少研究证实其在骨质疏松中起着重要作用。本文以“骨质疏松症”“环状RNA”为主题词检索中国知网、万方、Pubmed、Embase等数据库,将国内外关于环状RNA对骨质疏松症的作用及机制的研究进展综述如下。     

基于MAPK信号通路的丹参注射液体外调控小鼠前成骨细胞的增殖分化作用

摘要：目的:探究丹参注射液对小鼠前成骨细胞的增殖分化的影响及其与有丝分裂原活性蛋白激酶（MAPK）信号通路的关系。方法:将小鼠前成骨细胞分为4组,分别采用丹参稀释液浓度为0（对照组）,75,150,300 mg·L-1进行干预。采用细胞计数（CCK-8）试剂盒检测细胞光密度（OD）值;采用0.1%的茜素红溶液对细胞进行染色,并观察各组钙结节生成情况;采用实时荧光定量PCR法检测γ-羟基谷氨酸骨蛋白（BGP）及Runt相关基因2（Run×2） mRNA表达情况;采用蛋白免疫印迹法检测细胞外信号调节激酶2（ERK2）及其磷酸化状态（p-ERK1/2）、p-p38蛋白表达情况。采用抑制剂PD98059抑制ERK1/2通路,采用实时荧光定量PCR检测BGP及Run×2 mRNA表达。结果:各浓度丹参注射液组的OD值均高于对照组,其中300 mg·L-1丹参组各个孵育时间差异均有统计学意义（P<0.01）。各浓度丹参组钙结节数量均显著高于对照组,且呈浓度依赖性（P<0.05）。7 d后各浓度丹参注射液组的BGP及Run×2 mRNA表达显著高于对照组（P<0.01）,且呈剂量依赖性（P<0.05）。经PD98059抑制后,300 mg·L-1丹参注射液（SM）+PD组BGP及Run×2 mRNA表达显著低于SM组（P<0.05或P<0.01）。300mg·L-1丹参组p-ERK1/2蛋白表达量和相对蛋白密度显著高于对照组（P<0.01）; 300 mg·L-1丹参组p-p38蛋白表达与对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）。结论:丹参注射液对成骨细胞增殖、分化及矿化具有促进作用,其作用机制可能与激活MAPK通路中的ERK1/2细胞信号相关。     

甲状旁腺激素间歇性应用对大鼠成骨细胞分泌组的影响

目的 利用蛋白质组学技术研究甲状旁腺激素(PTH1-34)对大鼠成骨细胞分泌组的影响,为进一步研究唧促成骨作用机制、寻找新的骨代谢调节因子打下基础.方法 将大鼠成骨细胞分为PTH刺激组和对照组分别培养,收集第三周期6h末和24h末的无血清培养液,用透析-丙酮沉淀法富集培养液中的分泌蛋白质,然后通过双向电泳寻找差异蛋白,再通过质谱分析和数据库检索鉴定两组样品中差异蛋白的种类和性质.结果 6h末和24h末PTH刺激组的分泌组均有明显改变,初步鉴定其中23个差异表达蛋白,发现它们分别属于细胞骨架蛋白、翻译调控相关蛋白、蛋白降解相关蛋白、信号转导相关蛋白、热休克蛋白/分子伴侣、抗氧化酶、胰岛素样生长因子结合蛋白及与糖、脂代谢相关的酶等.结论 PTH间歇性应用可使成骨细胞分泌组发生明显改变,这些蛋白可能与PTH促成骨作用相关,本研究为进一步研究PTH促成骨机理、寻找新的骨代谢调节因子提供了实验依据.     

孕激素对人成骨样细胞膜型基质金属蛋白酶-1表达和明胶酶-A激活的影响

目的研究孕激素对人成骨样细胞MG-63膜型基质金属蛋白酶(MT1-MMP)表达和明胶酶-A激活的影响,探讨孕激素治疗绝经后骨质疏松症(OP)的作用机制.方法MG-63细胞用孕酮干预;半定量逆转录聚合酶链反应、Western杂交和激光共聚焦显微系统免疫荧光法分别检测MT1-MMPmRNA和蛋白质表达;明胶酶-A激活用明胶酶谱和酶联免疫吸附(ELISA)检测.结果观察到孕酮增强MG-63细胞MT1-MMPmRNA表达呈剂量依赖性,其中10-9mol/L孕酮组为对照组的(127±11)%(P＜0.01),10-8mol/L孕酮组为对照组的(171±19)%(P＜0.001).孕酮增强MG-63细胞MT1-MMP蛋白质表达呈剂量依赖关系,其中10-9mol/L孕酮组为对照组的(188±85)%(P＜0.001),10-8mol/L孕酮组为对照组的(233±25)%(P＜0.0001).激光共聚焦显微系统免疫荧光法证实孕酮促进MT1-MMP蛋白质表达增强,MT1-MMP蛋白质表达于细胞膜和细胞质中.孕酮对明胶酶-A激活无影响(P＞0.05),即孕酮诱导的MG-63细胞MT1-MMP表达增强不能增强明胶酶-A的激活.结论MT1-MMP在骨重建过程中起着维持骨形成的关键作用,孕激素可通过诱导人成骨样细胞MT1-MMP表达增强促进骨形成.     

乳铁蛋白促进成骨细胞增殖的最佳浓度及促进分化的最佳时间

目的 探索乳铁蛋白促进大鼠成骨细胞增殖的最佳浓度及1000μg/mL乳铁蛋白对促进成骨细胞分化的最佳时间。方法 用混合酶消化法分离大鼠颅盖骨成骨细胞进行原代培养;不同浓度乳铁蛋白干预成骨细胞,浓度分别为0、0.1、1、10、100、200、400、600、800和1000μg/mL,在1、3、5、7d后分别采用CCK-8法测定细胞增殖;用1000μg/mL的乳铁蛋白干预成骨细胞7、14、21d后,采用碱性磷酸酶染色法检测细胞内碱性磷酸酶的活性。结果 1.CCK-8法测定细胞增殖结果显示,低于100μg/mL浓度乳铁蛋白组其OD值随着浓度的增高而增高,而高于100μg/mL浓度乳铁蛋白组其OD值随着乳铁蛋白浓度的增高而递减;2.碱性磷酸酶染色法结果显示,1000μg/mL的乳铁蛋白在干预第21天时碱性磷酸酶活性最高。结论 100μg/mL乳铁蛋白是促进大鼠成骨细胞增殖的最佳浓度;1000μg/mL的乳铁蛋白促进成骨细胞分化作用呈时间依赖性。     

α-玉米赤霉醇对小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中OPG和RANKL蛋白表达的影响

目的 探讨α-玉米赤霉醇(α-zearalanol,α-ZAL)对小鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSCs)向成骨细胞增殖、分化的影响。方法 采用全骨髓培养差速贴壁法体外分离培养小鼠骨髓间充质干细胞,取第3代细胞分为空白对照组、雌二醇阳性对照组、低浓度α-ZAL组、中浓度α-ZAL组,高浓度α-ZAL组。镜下每天观察细胞形态变化,碱性磷酸酶染色鉴定成骨细胞纯度,MTT实验测定细胞增殖活性绘制细胞生长曲线,采用酶联免疫吸附法(ELISΑ)测定碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨形态发生蛋白2( Bone morphogenetic protein-2,BMP-2),运用蛋白免疫印迹法（Western blotting,WB）检测护钙素（Osteoprotegerin,OPG）和NF-KB受体活化配体（Receptor actiator of nuclear factor-KB ligand, RANKL）的蛋白水平表达变化。结果 不同浓度的α-玉米赤霉醇可显著的促进小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞增殖、分化,增加细胞活性（P<0.05）,明显提高小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化后ALP和BMP-2的表达（P<0.05）,并且显著的上调了成骨细胞内OPG/ RANKL的表达率（P<0.05）。结论 不同浓度的α-玉米赤霉醇可以促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞增殖、分化,并且通过上调OPG/ RANKL的表达率抑制成骨细胞细胞向破骨细胞分化,有望成为临床骨折疏松症治疗的激素替代药物。     

橄榄苦苷对成骨细胞增殖的影响

目的探讨橄榄苦苷不同药物浓度及不同作用时间对成骨细胞增殖的影响。方法采用酶消化法原代培养新出生48 h内SD大鼠颅骨成骨细胞,药物刺激组加人400、200l、100、50 ^g/ml橄榄苦苷,另设空白对照组。运用NBT/BCIP试剂盒进 行成骨细胞碱性磷酸酶染色鉴定,并采用四甲基偶氮唑蓝法（MTT法）检测应用不同浓度橄榄苦苷及不同作用时间对成骨细 胞增殖情况。结果与空白对照组比较,400l、200、100、50 pg/nL橄榄苦苷对成骨细胞均具有增殖作用,差异有统计学意义 (P <0. 05),不同时间点中100略/nL橄榄苦苷的溶度对成骨细胞的增殖作用最强（P <0.05),作用时间48和72 h后成骨细 胞的增殖率及OD值没有明显的差异(P >0. 05)。结论橄榄苦苷可以促进成骨细胞的增殖,可能通过增加成骨细胞OPG表 达并与成骨细胞膜上雌激素受体结合,促进成骨细胞的增殖来防治骨质疏松,但该机制有待于我们后期实验进一步研究。     

Rspo1通过Wnt/β-catenin信号通路调节成骨细胞分化的研究进展

在成骨细胞的分化增殖中,经典Wnt /β-catenin通路起着重要的调节作用;此通路中的任何一个因子都能影响成骨细胞的分化增殖。近几年里,大量研究证明R-脊椎蛋白家族巳成为Wnt/β-catenin信号通路的重要调节因子。本文就Rspo1通过Wnt/β-catenin信号通路调控影响成骨细胞分化增殖的研究进展作一综述。     

锶盐对高浓度地塞米松作用下大鼠成骨细胞的影响

目的 探讨雷奈酸锶(Sr)对高浓度地塞米松(Dex)作用下大鼠成骨细胞（OB)的影响。方法 采用大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)来源的成骨细胞,运用MTT试剂盒和AKP试剂盒分别测定Sr对细胞增殖和分化的影响,定量PCR方法测定Sr对高浓度地塞米松作用下成骨钙素（OC)和转化生长因子-β(TGF-β)表达的影响。结果 Sr浓度在10-5、10-4 mol/L时,能够促进OB增殖和分化(P < 0. 01); Sr浓度为10-4mmol/L能够有效拮抗高浓度Dex( 10-5 mol/L)对成骨细胞分化抑制作用（P <0.01),并能逆转Dex对成骨相关基因OC和TGF-β的抑制作用(P <0. 05,P <0. 01)。结论 Sr能够对大鼠BMSCs来源的成骨细胞的增殖、分化有促进作用,同时10-4 mol/L Sr可以拮抗Dex( 10-5 mol/L)对ALP和成骨相关基因的抑制作用。为Sr防治糖皮质激素性骨质疏松提供了细胞学依据。