人细胞色素P4502C9cDNA的克隆,鉴定及真核细胞表达重组质粒的构建

从人肝组织中提取总ＲＮＡ，用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增人细胞色素Ｐ４５０２ＣＯ的ｃＤＮＡ。     

乙肝病毒e抗原基因在大肠杆茵中高表达

取pZD 8703质粒DNA(本室构建的高表达乙肝核心抗原基因质粒)用Ava Ⅰ酶切开,Bal 31酶消化,加四种核甘酸dNTP、DNA聚合酶大片段酶补平后,用T_4 DNA连接酶连接,再用EcoRI酶消化,回收EcoRI小片段连接到pJLA 503的EcoRI位点,转化受体菌JM103,获得在P_RP_L启动子控制下,由温度调节CIts 857开启和关闭的高表达乙肝e抗原(HBeAg)的重组体。用抗HBe-β)单克隆酶标抗体配套的ELISA双抗体夹心法测定经超声波处理的细菌原液,HBeAg的终效价在1:10240以上,只含少量HBeAg。可以代替血清HBeAg用作配套检测试剂。     

P185erbB2单抗可变区基因克隆及人鼠嵌合抗体真核高效表达载体构建

P185是erbB_2(HER2/neu)基因编码的具酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白,在多种上皮细胞来源的恶性肿瘤中过表达,且与肿瘤的耐药、转移、复发有关.应用P185单抗进行肿瘤的诊断和判断预后已得到广泛应用,美国FDA已批准一株人化抗体应用于临床治疗erbB_2高表达的乳腺癌,但国内尚无人化抗体应用于临床治疗.为获得具有临床治疗价值的人化抗体,消除HAMA反应,本文从自制的10株抗P185胞外区的单抗中选出抑制erbB_2高表达的肿瘤细胞增殖活性最高的一株(C25)进行人化改造.C25单抗在体外对SKBR3细胞增殖的仰制率可达60.63%,属于小鼠IgG1亚类、к轻链.根据C25的IgG亚类选用Winter等设计的引物,以BT-PCR方法从杂交瘤细胞株中扩增轻、重链可变区基因.分别克隆     

阳春砂基于转录组的萜类合酶基因挖掘及一个单萜合酶基因的克隆

【目的】深入挖掘阳春砂转录组中挥发性萜类合酶相关基因,为全面认识阳春砂挥发性萜类代谢途径和分子调控模式奠定基础。【方法】整理前期工作获得的阳春砂2个转录组的数据,筛选已注释的及利用本地blast方法再注释的萜类合成途径的unigene;并通过对部分候选unigene的表达量与挥发性萜类化合物含量的相关性分析及生物信息学分析,进一步筛选出相关基因;采用PCR及重组载体构建的方法克隆其中一个单萜合酶基因,并对其编码蛋白序列进行分析。【结果】筛选得到10个挥发性萜类合成上游途径相关unigene及11个下游萜类合酶基因;相关性分析证明候选基因与阳春砂主要挥发性萜类有较强相关性;并成功克隆得到Av TPS1基因,其序列包含1 803 bp的开放阅读框,编码600个氨基酸;其编码蛋白含有单萜合酶蛋白特有的DDXXD、RRX8W和NSE/DTE等保守基序,N端含有一段叶绿体转运肽;系统进化分析表明Av TPS1属于TPS-b亚家族。【结论】结合转录组、表达谱数据的深入挖掘和与挥发性萜类化合物数据的关联,有效筛选出了阳春砂多个值得后续研究的萜类合酶基因;其中对Av TPS1的克隆及生物信息学分析为后续功能鉴定提供了基础。     

三七几丁质酶基因PnCHI1的克隆及表达特性分析

几丁质酶(chitinase,EC3.2.1.14)广泛存在于多种生物体中,催化水解几丁质(chitin),在抗真菌防卫反应体系中具有重要作用,同时几丁质酶还调控植物的生长和发育,参与细胞的程序性死亡(programmed cell death,PCD)。该实验基于三七Panax notoginseng中编码几丁质酶的EST序列设计引物,采用快速扩增cDNA末端技术,克隆得到1个新的几丁质酶基因的全长cDNA序列,命名为PnCHI1。PnCHI1的cDNA全长为1 022 bp,含有822 bp的开放阅读框,26 bp 5'-非翻译区以及174bp的3'-非翻译区,编码具有273个氨基酸的蛋白质。该基因编码的蛋白属于糖苷水解酶19家族成员,进化树分析表明PnCHI1编码的氨基酸序列属于IV类几丁质酶。qRT-PCR分析结果显示,植物信号分子水杨酸、茉莉酸甲酯、H_2O_2和乙烯处理可均明显诱导三七根中PnCHI1的转录水平;三七叶片接种人参链格孢Altemaria panax后,PnCHI1的表达量迅速升高,呈波动上升趋势;外源茉莉酸甲酯预处理三七根部,PnCHI1的表达水平上升,接种茄腐镰刀菌Fusarium solani后,PnCHI1的转录水平急剧上升,接种后4 h达到最高转录水平;而无菌水预处理三七受茄腐镰刀菌侵染过程中,PnCHI1的表达量逐渐上升,至48h达到最大值。上述结果表明PnCHI1参与三七对根腐病菌以及黑斑病菌的防卫反应。     

茯苓细胞色素P450还原酶基因的克隆与生物信息学分析

目的从茯苓Poria cocos中克隆出细胞色素P450还原酶(CPR)基因,并对其进行生物信息学分析。方法利用茯苓转录组注释信息,通过RACE扩增得到茯苓CPR基因(Pc CPR)全长,并PCR得到对应基因组DNA序列。通过生物信息学方法,对该基因编码蛋白的特征进行分析,I-TASSER模拟出蛋白三级结构,MEGA构建蛋白系统进化树。结果获得含有完整开放阅读框(ORF)的c DNA全长2 514 bp(Gen Bank号为KP768251),Pc CPR的基因组DNA 5 292bp(Gen Bank号为KP896487),含4个外显子、3个内含子。基因编码732个氨基酸的蛋白,相对分子质量81 147,等电点(p I)为5.39,为不稳定性亲水蛋白,非分泌蛋白,且不具有信号识别功能。蛋白定位于内质网上,第7~22位氨基酸为跨膜区;具有2个黄素结合的保守结构域,FAD、NADP的结合位点各自在蛋白三级结构空间上相邻近。同源性分析显示,Pc CPR与担子菌CPR的相似性明显高于子囊菌CPR。结论成功从茯苓中克隆得到Pc CPR基因,为进一步研究Pc CPR及相关代谢提供基础。     

人成牙本质细胞L型钙离子通道特异性基因片段的克隆研究

目的:克隆人成牙本质细胞L型钙离子通道α1亚基D亚型特异性基因片段.方法:选取新鲜拔除的健康恒牙,利用牙科专用慢速切锯制备牙齿切片,采用酶消化法分离出完整的人成牙本质细胞,利用RT-PCR技术直接从人成牙本质细胞中克隆L型钙离子通道α1亚基D亚型特异性基因片段,将其亚克隆入pGM-T载体进行序列测定.结果:从人成牙本质细胞中获得452bp的特异性片段.序列分析表明,其与GenBank中已登录的人L型钙离子通道α1亚基D亚型特异性基因序列一致.结论:成功地从人成牙本质细胞中克隆到人成牙本质细胞L型钙离子通道α1亚基D亚型的特异性基因序列片段.     

p53/p21融合基因的克隆及其对Tca8113细胞生长的影响

目的 应用野生型p53及p21组成融合基因，为口腔鳞癌的基因治疗提供一种新的候选融合基因。方法 用反转录PCR从健康人胚肺细胞(WI-38)中获得p21基因cDNA，将其与p53融合，构建成重组质粒pcDNA-p53／p21，并将其转染至口腔鳞癌细胞Tea8113，采用RT-PCR和Western blot证实融合基因的表达，通过集落形成实验及^3H-TdR摄入法检测p53／p21融合基因对口腔鳞癌细胞的抑制作用。结果 WI-38细胞中获得一条长约为500bp的条带，经测序证实其为p21全长编码序列，将其与p53构建成融合基因，获得融合蛋白p53／p21的表达。集落形成实验及^3H-TdR摄入法观察到p53／p21融合基因对口腔鳞癌细胞的生长具有明显的抑制作用；经RT-PCR和Western blot证实这是p53／p21融合表达的结果。结论 p53／p21融合基因可以抑制口腔鳞癌细胞的生长，且其抑制细胞生长程度大于p53和p21单独作用，从而为口腔鳞癌细胞的基因治疗提供了一种新的候选靶基因。     

人血管内皮生长因子基因的克隆及在人成肌细胞中的表达

目的：克隆人血管内皮生长因子基因VEGF165片段，构建pCDNA3/VEGF165真核表达载体，观察其在人成肌细胞中的表达。方法：采用逆录聚合酶链式反应（RT－PCR）技术，从人肝癌细胞株SMMC－7721中扩增出血管内皮生长因子VEGF165基因片段，通过DNA重组技术将该基因片段重组于pCDNA3真核表达载体上，构建成pCDNA3/VEGF165重组质粒，分别用酶切电泳分析及DNA测序的方法对重组DNA进行鉴定，应用脂质体介导的基因转移技术将这一表达载体导入体外培养的人成肌细胞内，并用免疫组化法观察其表达。结果：经酶切电泳分析和DNA测序证实，本实验克隆的基因片段为人VEGF165cDNA，重组质粒pCDNA3/VEGF165转染人成肌细胞后，VEGF表达明显增高。结论：本实验成功地克隆了VEGF165基因，为进一步研究用肌肉细胞内转染VEGF基因的方法来恢复或增强放疗后组织的血管生成能力奠定了基础。