透明质酸结合蛋白抑制肿瘤细胞增殖的研究

目的从人脑中克隆透明质酸结合蛋白( hbHABP)基因,研究其对各种肿瘤细胞体外增殖的影响.方法根据已知透明质酸结合蛋白(HABP)DNA序列,设计引物,从人脑cDNA文库中克隆,构建真核细胞表达载体(pcDNA3-hbHABP),转染到人前列腺癌、乳腺癌、肺癌及黑色素瘤细胞中,观察体外细胞生长变化.结果所有转染pcDNA3-hbHABP的肿瘤细胞相对于转染空载体pcDNA3的对照组细胞,出现生长受抑制现象,在软琼脂上的克隆形成数量也明显减少.结论hbHABP可能是一种新的抑制肿瘤细胞生长的物质.     

人甲状腺过氧化物酶抗原决定簇的基因克隆与序列分析

应用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ＿ＰＣＲ）方法快速克隆人甲状腺过氧化物酶（ｈＴＰＯ）抗原决定簇基因１７０２～２６２２（编号相对于起始密码，编码ＡＡ５６８～ＡＡ８７４）。将此片段重组入ＰＵＣ１８质粒，并用ＰＣＲ＿双链ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）方法测定全部顺序。结果表明确实克隆到ｈＴＰＯ（１７０２～２６２２）区的基因片段，有两个单碱基，但未造成编码氨基酸改变     

P185erbB2单抗可变区基因克隆及人鼠嵌合抗体真核高效表达载体构建

P185是erbB_2(HER2/neu)基因编码的具酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白,在多种上皮细胞来源的恶性肿瘤中过表达,且与肿瘤的耐药、转移、复发有关.应用P185单抗进行肿瘤的诊断和判断预后已得到广泛应用,美国FDA已批准一株人化抗体应用于临床治疗erbB_2高表达的乳腺癌,但国内尚无人化抗体应用于临床治疗.为获得具有临床治疗价值的人化抗体,消除HAMA反应,本文从自制的10株抗P185胞外区的单抗中选出抑制erbB_2高表达的肿瘤细胞增殖活性最高的一株(C25)进行人化改造.C25单抗在体外对SKBR3细胞增殖的仰制率可达60.63%,属于小鼠IgG1亚类、к轻链.根据C25的IgG亚类选用Winter等设计的引物,以BT-PCR方法从杂交瘤细胞株中扩增轻、重链可变区基因.分别克隆     

茯苓细胞色素P450还原酶基因的克隆与生物信息学分析

目的从茯苓Poria cocos中克隆出细胞色素P450还原酶(CPR)基因,并对其进行生物信息学分析。方法利用茯苓转录组注释信息,通过RACE扩增得到茯苓CPR基因(Pc CPR)全长,并PCR得到对应基因组DNA序列。通过生物信息学方法,对该基因编码蛋白的特征进行分析,I-TASSER模拟出蛋白三级结构,MEGA构建蛋白系统进化树。结果获得含有完整开放阅读框(ORF)的c DNA全长2 514 bp(Gen Bank号为KP768251),Pc CPR的基因组DNA 5 292bp(Gen Bank号为KP896487),含4个外显子、3个内含子。基因编码732个氨基酸的蛋白,相对分子质量81 147,等电点(p I)为5.39,为不稳定性亲水蛋白,非分泌蛋白,且不具有信号识别功能。蛋白定位于内质网上,第7~22位氨基酸为跨膜区;具有2个黄素结合的保守结构域,FAD、NADP的结合位点各自在蛋白三级结构空间上相邻近。同源性分析显示,Pc CPR与担子菌CPR的相似性明显高于子囊菌CPR。结论成功从茯苓中克隆得到Pc CPR基因,为进一步研究Pc CPR及相关代谢提供基础。     

人成牙本质细胞L型钙离子通道特异性基因片段的克隆研究

目的:克隆人成牙本质细胞L型钙离子通道α1亚基D亚型特异性基因片段.方法:选取新鲜拔除的健康恒牙,利用牙科专用慢速切锯制备牙齿切片,采用酶消化法分离出完整的人成牙本质细胞,利用RT-PCR技术直接从人成牙本质细胞中克隆L型钙离子通道α1亚基D亚型特异性基因片段,将其亚克隆入pGM-T载体进行序列测定.结果:从人成牙本质细胞中获得452bp的特异性片段.序列分析表明,其与GenBank中已登录的人L型钙离子通道α1亚基D亚型特异性基因序列一致.结论:成功地从人成牙本质细胞中克隆到人成牙本质细胞L型钙离子通道α1亚基D亚型的特异性基因序列片段.     

苦参查尔酮异构酶的基因克隆与表达分析*

目的为明晰苦参查尔酮异构酶（sfCHI）的结构基因信息及其在苦参黄酮类化合物生源路径中的表达调控机理。方法 本实验以苦参为研究对象,基于其转录组学数据,克隆sfCHI基因并针对该cDNA序列展开生物信息学分析,采用半定量PCR方法检测安徽产苦参不同组织中sfCHI基因表达情况。结果 结果显示苦参sfCHI基因的cDNA序列长度为1 265 bp,含有630 bp的开放式阅读框(ORF),编码209个氨基酸;序列分析表明sfCHI与狭叶羽扇豆查尔酮异构酶基因相似性最高,达89.95%;进化树分析该基因与大豆、野大豆等植物的亲缘关系较近;半定量PCR结果显示sfCHI基因在苦参根中表达量最低,在叶、叶柄与茎中的表达未见明显差异。结论 本研究通过对苦参查尔酮异构酶的基因克隆与不同组织间的表达分析,初步明确了该基因的序列信息与理化特征,这对进一步研究苦参黄酮类物质生物合成机制将起到积极的推动作用。     

携带人野生型PKGⅠα基因的重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:克隆人PKGⅠa基因,构建其重组腺病毒载体。方法:用RT-PCR方法从人肺动脉平滑肌组织中扩增PKGⅠa基因全长,经T/A克隆后,亚克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上,构建穿梭质粒pAdTrack-PKGⅠα。PmeⅠ酶切pAdTrack- PKGⅠα,然后分别将腺病毒骨架质粒pAdEasy-1和穿梭质粒pAdTrack-PKGⅠα转化至BJ5183感受态细菌中进行同源重组,PacⅠ酶切线性化重组质粒AdCMV-PKGⅠα后转染Ad293细胞进行病毒包装和扩增。检测PKGⅠα基因的表达,并用绿色荧光蛋白(GFP)法测定其滴度。结果:用RT-PCR方法,从人肺动脉中层扩增出PKGⅠα,测序证实为人PKGⅠα基因。构建了PKGⅠα基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒保存液。结论:成功地克隆了人PKGⅠα基因,并构建其重组腺病毒载体,为进一步研究PKGⅠα基因在低氧肺血管重建中的作用提供了有效的基因转移载体。     

人单核细胞趋化蛋白－1（MCP－1）基因的PCR扩增、克隆及序列分析

本文报道用植物血凝素（ＰＨＡ）诱导健康人外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ，包括单核细胞和淋巴细胞），提取细胞总ＲＮＡ，反转录合成ｃＤＮＡ第一链，再以其为模板进行ＰＣＲ，得到了编码成熟单核细胞趋化蛋白－１（ＭＣＰ－１）的ｃＤＮＡ。该ｃＤＮＡ用ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ双酶切后，回收含ＭＣＰ－１基因的长约２８０ｂｐ的ＤＮＡ片段，插入到经ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ双酶切的ｐＵＣ１９载体中，进行序列分析。结果表明，ＭＣＰ－１中第１２个氨基酸的编码序列与国外报道的不同。由ＴＧＴ变成了ＴＧＣ，但编码相同的氨基酸即半胱氨酸，其余的编码序列则完全相同，说明ＭＣＰ－１的基因型可能存在着多态性。     

大鼠肝再生增强因子的基因克隆及序列分析

背景:肝再生增强因子是一种重要的次级肝再生因子,能够特异性地促进肝脏再生.目的:将乳鼠肝脏提取的RNA,利用特异引物克隆到肝再生增强因子基因,对其进行了生物信息学分析.设计、时间及地点:基因分子学体外实验,于2008-03/05在河南大学生命科学学院神经生物学实验室完成.材料:SPF级3日龄Wistar大鼠肝组织.方法:取3日龄Wistar大鼠肝组织.按异硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法抽提肝组织总RNA,按分子生物学实验指南的步骤进行反转录-聚合酶链反应方法扩增目的片段,用凝胶同收试剂盒回收纯化目的基因,连接T载体,转入大肠杆菌,提取质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司测序.应用分子生物学软件对测序结果进行分析.主要观察指标:聚合酶链反应扩增条带观察;测序结果分析;丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化位点的预测;系统进化树分析.结果:聚合酶链反应扩增结果与目的片段位置一致,测序结果表明为肝再生增强因子mRNA,基因全长378 bp,在人、牛、小鼠、斑马鱼等物种中高度保守.结论:实验成功克隆了大鼠肝再生增强因子基因.