C99引导淀粉样蛋白前体裂解过程的活体细胞研究

目的 构建含有Swedish突变和Flemish突变的荧光真核表达系统,研究淀粉样蛋白前体(APP)酶解过程.方法 通过聚合酶链式反应(PCR)得到编码Flemish突变的APP最后300个碱基片段(C99)、蓝色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白碱基序列(YFP),生物合成含有Swedish突变的APP中间54个碱基片段(54 bp),利用基因工程技术将CFP、54 bp、YFP、C99片段克隆至载体质粒pcDNA3.0中,通过酶切、PCR、测序鉴定最终得到重组质粒pcDNA3.0-CFP-54 bp-YFP-C99,并将其转染至人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)中,利用激光共聚焦显微镜观察荧光表达;检测荧光共振能量转移(FRET),以及进行β淀粉样蛋白(Aβ)免疫细胞化学染色.结果 (1)基因序列分析证明重组质粒构建成功.(2)利用激光共聚焦显微镜观察转染细胞,发现融合基因能够准确表达蓝色和黄色荧光.(3)FRET检测发现CFP-54bp-YFP-C99可以发生β和γ裂解产生Aβ,沉积在细胞内、胞膜上以及细胞间隙;CFP-54bp-YFP不能发生β裂解.(4)免疫细胞化学染色证实Aβ在细胞膜、胞浆内以及细胞间隙聚集沉积.结论 (1)重组质粒能够完成APP的有序裂解产生Aβ.(2)成功实现在活体细胞中观察APP裂解.(3)Aβ有可能产生于APP由胞浆至胞膜的运输过程中.(4)C99对于APP被裂解有重要意义,可能起到信号肽样的引导定位作用.     

结缔组织生长因子对肾性高血压大鼠心肌纤维化的影响及机制研究

目的从分子水平探讨结缔组织生长因子（CTGF）在肾血管性高血压大鼠左心室重构发生、发展中的作用。方法构建肾血管性高血压大鼠（RHR）模型，并以假手术实验大鼠（SOR）为对照，运用免疫组化法对CTGF、TGF-β1在左室心肌的分布及表达进行半定量分析；用RT-PCR法检测心肌组织CTGF mRNA、TGF-β1mRNA；并观察左室心肌胶原形态，检测胶原容积分数、血清I型前胶原羧基端前肽和胶原浓度。结果在同周龄RHR组CVF、PJP、Coll明显高于SOR组（P〈0．01）；在同周龄RHR组左室心肌中的CTGF、TGFβ1表达和CTGF mRNA、TGFβ1mRNA较SOR组明显增强（P〈0．05）；在RHR和SOR组左室心肌中的cTGF、TGF-β1表达12周大鼠明显高于6周大鼠（P〈0．05）；相关分析表明，CTGF与CTGF mRNA（r=0．815，P〈0．01）、TGF-β1（，=0．626，P〈O．05）、CVF（r=0．742，P〈0．01）、Coll（r=0．793，P〈0．01）、PICP（r=0．675，P〈0．01）均呈正相关。结论CTGF参与了肾血管性高血压大鼠心肌纤维化的形成。     

组织工程化人工神经的研究与进展

自体神经移植是治疗周围神经缺损的标准方法,但会造成供区神经损伤.随着生物工程技术的发展,目前已应用组织工程技术构建了人工神经导管,为修复长段周围神经缺损提供了新的方法和思路.     

调节食欲—生殖的信号肽在雄激素致不孕大鼠中的表达及滋肾？…

目的 探讨雄激素不孕大鼠（ＡＳＲ）肥胖及无排卵的中枢机制及滋肾阴药的作用。方法 给出生９日龄ＳＤ雌性大鼠一次性皮下注射丙酸睾丸酮，建立ＡＳＲ模型。用原位杂交、双标原位杂交的方法检测与肥胖发生有关的几种信号肽／激素如神经肽Ｙ（ＮＰＹ）、瘦素（ｌｅｐｔｉｎ）受体长体（ＯＢ－Ｒｂ）、前阿黑皮素原（ＰＯＭＣ）ｍＲＮＡ在ＡＳＲ下丘脑弓状核（ＡＲＣ）的表达含量和其关系，以及灌服滋肾阴药后上述指标的变化。结果     

Dickkopf-1时间分辨免疫荧光分析方法的建立及其在肺癌诊断中的应用

目的 建立Dickkopf-1(DKK-1)时间分辨免疫荧光分析(TR-IFMA)方法,并评价其在肺癌诊断和病理分期中的价值.方法 用双抗夹心原理建立DKK-1 TR-IFMA,并对其灵敏度、批内、批间差异和准确性等各项指标进行考核.同时用以测定212例肺癌、72例肺良性疾病患者和120名健康人血清DKK-1含量,以分析血清DKK-1水平与肺癌不同临床病理特性的相关性.结果 DKK-1TR-IFMA的稳定性好,线性宽,其检测灵敏度为0.08μg/L,批内和批间变异系数均<6.5%,与商业ELISA试剂盒相关性好(r=0.972,P=0.01).肺癌组血清DKK-1水平[31.93(79.47～18.03)μg/L]显著高于肺良性疾病组[15.25(18.41～11.49)μg/L]和正常对照组[13.90(16.91～11.02)μg/L],但DKK-1水平与年龄、性别、肺癌病理组织类型无关,与TNM分期(r=0.37,P<0.001)、有无淋巴结转移(r=0.52,P<0.001)和远处转移(r=0.62,P=0.001)显著相关;血清DKK-1诊断肺癌的总敏感度为68.4%,特异度为92.2%,准确性为82.1%,阳性预测值为90.6%,阴性预测值为72.5%;血清DKK-1诊断小细胞性肺癌的敏感度和准确性稍高于非小细胞性肺癌(70.7%vs 69.5%,85.6%vs 80.7%).结论 DKK-1可作为一项肺癌血清学标志,适用于肺癌的辅助诊断和病理分期.TR-IFMA检测血清DKK-1方法准确可靠,且为肺癌的DKK-1定量检测提供了技术平台.     

2型糖尿病及合并冠心病糖尿病患者脂联素水平观察

目的：观察脂联索(adiponectin)在2型糖尿病(DM)及DM合并冠心病时的浓度变化．并探讨影响2型糖尿病患血浆脂联索水平的因素。方法：用ELISA方法在2型糖尿病组(无或合并冠心病)、非糖尿病正常对照组测定血浆脂联索水平。结果：无冠心病的糖尿病组血浆脂联索水平较非糖尿病正常对照组明显降低．合并冠心病的糖尿病组更低。结论：2型糖尿病中血浆脂联索水平的明显下降可作为冠心病的危险标志。     

工频电磁场对小鼠骨髓间充质干细胞骨形态发生蛋白2和转化生长因子β1 mRNA表达的刺激

背景:研究证实电磁场刺激能够促进多种骨生长因子的合成与分泌,而某些生长因子具有诱导骨髓间充质干细胞定向分化成骨的作用。目的:分析工频电磁场对体外培养的小鼠骨髓间充质干细胞骨形态发生蛋白2和转化生长因子β1mRNA表达的影响。设计:单一样本、区组设计,观察对比动物实验。单位:华中科技大学同济医学院附属同济医院创伤外科。材料:实验于2005-02/12在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨外科实验室完成。①选取清洁级昆明种小鼠20只,作为实验用骨髓间充质干细胞的来源。②电磁场发生器由武汉市海军工程大学研制,能生成场强为0～100mT的连续可调的50Hz正弦波电磁场。③引物均由北京赛百胜生物工程公司合成。方法:①小鼠以颈椎脱臼法处死,取双侧股骨和胫骨,体外分离培养骨髓间充质干细胞,取第2代细胞用于实验。②不同强度电磁场刺激实验:设立阴性对照组、阳性对照组、电磁场0.4,0.8,1.6mT刺激组,每组均取5瓶第2代细胞。阴性对照组、阳性对照组均不给予电磁场刺激,但阳性对照组于传代时加入含成骨性诱导剂(含10-8mol/L地塞米松,10mmol/Lβ-甘油磷酸钠,50mg/LVitaminC)的培养基;电磁场0.4,0.8,1.6mT刺激组在细胞贴壁后分别于0.4,0.8,1.6mT场强中进行电磁场刺激,每天均连续刺激1h,5d后进行指标检测。③相同场强不同作用时间电磁场刺激实验:设立阴性对照组、电磁场1.6mT刺激15,30,60min组,每组均取5瓶第2代细胞。阴性对照组不进行电磁场刺激;电磁场1.6mT刺激15,30,60min组在1.6mT场强条件下每天分别给予15,30,60min的连续电磁场刺激,5d后进行指标检测。④RT-PCR技术检测各组细胞骨形态发生蛋白2与转化生长因子β1mRNA的表达。主要观察指标:①不同强度电磁场刺激对小鼠骨髓间充质干细胞骨形态发生蛋白2与转化生长因子β1mRNA表达的影响。②相同场强不同作用时间电磁场刺激小鼠骨髓间充质干细胞骨形态发生蛋白2与转化生长因子β1mRNA表达的影响。结果:①电磁场刺激5d后,与阴性对照组比较,阳性对照组及电磁场0.4,0.8,1.6mT刺激组骨形态发生蛋白2、转化生长因子β1mRNA的表达均明显增强(P均<0.01);且电磁场1.6mT刺激组骨形态发生蛋白2mRNA的表达达到最大值(57.74±0.23)%,电磁场0.4mT刺激组转化生长因子β1mRNA的表达达到最大值(126.20±0.21)%。②电磁场刺激5d后,与阴性对照组比较,电磁场1.6mT刺激15,30,60min组骨形态发生蛋白2与转化生长因子β1mRNA的表达均明显增强(P均<0.01);且电磁场1.6mT刺激60min组两种因子mRNA的表达分别达到最大值(28.06±0.11)%和(75.20±0.16)%。结论:适当强度及作用时间的工频电磁场刺激,能够明显促进体外培养的小鼠骨髓间充质干细胞骨形态发生蛋白2与转化生长因子β1mRNA的表达。     

基质金属蛋白酶及其抑制物与肿瘤转移研究进展

基质金属蛋白酶是一个大家族,因其需要Ca^2＋、Zn^2＋等金属离子作为辅助因子而得名,其家族成员具有相似的结构,一般由5个功能不同的结构域组成：①疏水信号肽序列;②前肽区,主要作用是保持酶原的稳定。当该区域被外源性酶切断后,MMPs酶原被激活;③催化活性区,有锌离子结合位点.     

青霉素G酰化酶通用表达载体的构建方法初探

结合信号肽预测软件(Signal P)对现有的青霉素G酰化酶(PGA)的大肠杆菌-枯草杆菌穿梭表达质粒pZOl进行信号肽的合理设计,在其C-端置换2个氨基酸,即引入NotI酶切位点序列,从而构建成PGA的通用表达载体。将粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)的PGA基因导入其中,构建成表达质粒pefpganoti．,转入枯草杆菌进行表达,测活结果显示,表达产物具有生物活性(酶的平均活力为0．18U／ml发酵液)。为进一步应用信号肽预测软件进行表达系统的研究、设计打下了基础。     

脂肪特异性蛋白27（Fsp27）基因延缓四氯化碳所致实验大鼠肝纤维化

目的 探讨脂肪特异性蛋白27（Fsp27）基因对活体肝纤维化进程的调节作用.方法 分离原代肝星状细胞（HSCs）,采用PCR技术检测在原代HSCs及活化HSCs中的Fsp27基因表达；构建携带Fsp27目的基因的慢病毒；建立肝纤维化模型；慢病毒转染模型鼠肝脏,对实验大鼠行肝脏病理切片检查,采用ELISA法和放射免疫法分别检测肝脏及血浆纤维蛋白含量.结果 Fsp27基因在原代HSCs及活化HSCs中表达差异有统计学意义（P＜0.01）；成功构建了Fsp27基因的慢病毒载体；成功建立了肝纤维化活体模型；Fsp27基因慢病毒成功转染大鼠肝脏,Fsp27基因减轻了肝脏的纤维化程度.结论 Fsp27基因具有延缓活体肝纤维化进程的作用.