表达干扰素-α2b重组长双歧杆菌工程菌的制备

目的构建表达人干扰素-α2b(hIFN-α2b)蛋白的双歧杆菌工程菌,并验证靶蛋白的表达水平。方法人工合成hIFN-α2b基因,插入双酶切的pBAD质粒,构建重组质粒pBAD-IFN。制备双歧杆菌感受态,用pBAD-IFN电转化后PCR鉴定、筛选阳性克隆,筛选的阳性双歧杆菌克隆在L-阿拉伯糖诱导下表达靶蛋白,并进行Western blot检测。结果测序和双酶切鉴定表明成功构建重组质粒pBAD-IFN,Western blot检测证明氨苄青霉素筛选出的该质粒转化双歧杆菌阳性克隆经L-阿拉伯糖诱导表达分子质量单位为18ku的hIFN-α2b蛋白。结论 hIFN-α2b表达载体pBAD-IFN转化双歧杆菌后可表达hIFN-α2b蛋白。     

核定位信号肽在异种移植动物模型转人α1,2-岩藻糖苷转移酶基因小鼠制备中的作用

目的探讨核定位信号肽（NLS）在转人α1，2-岩藻糖苷转移酶（HT）基因小鼠制备中的作用。方法将受精卵随机分为3组，采用显微注射的方法制备转基因小鼠。实验组：将NLS转基因构件与人HT转基因构件同时导入细胞质；对照Ⅰ组：将人HT转基因构件导入细胞质；对照Ⅱ组：将人HT转基因构件导入细胞核。应用聚合酶链反应（PCR）、Southern杂交及逆转录（RT）-PCR等方法检测人HT基因在G0代小鼠体内的整合与表达，应用流式细胞计数（FCM）检测转基因小鼠外周血单核细胞（PBMCs）表面H抗原与α-Gal抗原的表达。结果实验组与对照Ⅰ组G0代小鼠的出生率33．8%（46／136）及35．4%（23／65）高于对照Ⅱ组10．2％（51／498）（P〈0．01），实验组人HT基因的整合率（30．4%，14／46）高于对照Ⅰ组（0，0／23）与对照Ⅱ组（11．8%，6／51，P〈0．01），实验组人HT基因的表达率（19．6%，9／46）也高于对照Ⅰ组（0，0／23）和对照Ⅱ组（5．9%,3／51，P〈0．01），人HT mRNA在小鼠心、肝、肾和骨骼肌组织中均表达阳性。转基因小鼠PBMCs表面H抗原表达阳性，表达强度为人的85％～190%，同时α-Gal抗原表达显著降低。为正常小鼠的5%～12％。转基因小鼠已经稳定传3代。结论NLS基因与目的基因细胞质共注射是制备转基因小鼠简便实用的新方法。     

人重组LIGHT-Fc分子的真核表达及其抗肿瘤活性研究

目的：构建人LIGHT-Fc基因的真核表达质粒，并表达获得有较高生物学活性的纯化人LIGHT-Fc融合蛋白。方法：从cDNA文库中PCR扩增LIGHT全长编码基因，并导入克隆载体。测序证实后，继续用PCR扩增其膜外区cDNA，用重叠延伸技术(SOE)引入cD137信号肽基因。将SOE产物与hlgG1Fc基因一起装入真核表达载体pcDNA3中，瞬时转染293T细胞，用夹心ELISA检测其表达情况，经蛋白A亲和纯化，用SDS-PAGE检测其纯度与Mr，并以肿瘤细胞为靶细胞，检测其生物学活性。结果：测序证实构建的LIGHT与LIGHT-Fc cDNA阅读框完整，连接部位序列正确；ELISA和SDS-PACE证实LICHT-Fc融合蛋白的表达与纯度；MTT证明人LIGHT-Fc蛋白对一些肿瘤细胞系具有生长抑制作用。结论：获得了有抗肿瘤活性的纯化hLIGHT-Fc融合蛋白，为探讨LIGHT在免疫自稳调节中的地位、结合相应受体后的动力学与信号转导机制，以及探索LIGHT的其他生物学功能奠定了坚实的实验基础。     

载脂蛋白B信号肽基因与冠心病关系研究

利用聚合酶链反应技术对１５０名正常人及４３例冠心病患者的载脂蛋白Ｂ５’端信号肽插入／缺失基因多态性研究，结果表明：①中国湖北人插入等位基因相关频率是０７３；②冠心病组与正常对照组间两种等位基因相对频率分布差异无显著性；③正常对照组内，缺失纯合子基因型者血浆甘油三脂水平明显低于插入纯合子基因型的水平（Ｐ＜００５）。     

SEA基因与GPI信号肽序列融合基因的真核表达载体的构建和序列分析

目的：将超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A（staphylococcus enterotoxinA,SEA)基因的人胎盘碱性磷酸酶（hPLAP-1)C末端信号肽序列，即糖基化磷脂酰肌醇（glycosyl-phosphatidyl inositol,GPI)附着信号序列，拼接成融合基因，并构建该融合基因的真核表达载体。方法：利用基因SOEing法，分别扩增hPLAP-1 C末端信号肽序列和SEA基因，然后将二段基因拼接起来，拼接后与pGEM-T克隆载体连接，再亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1( )中，测序鉴定。结果：分别成功扩增出hPLAP-1 C末端信号肽序列131bp和SEA基因789bp，并将二段基因序列成功拼接（901bp），且成功构建了真核表达载体pcDNA3.1( )/SEA-GPI，经测序是正确的。结论；真核表达载体pcDNA3.1( )/SEA-GPI的构建，为研究SEA－GPI抗肿瘤作用奠定了基础。     

HB-EGF对HSC-T6细胞Ras/ERK通路的激活及对MMP-2、TIMP-1表达的影响

目的 观察肝素结合性表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)激活肝星状细胞(HSC)过程中Ras/ERK信号通路的变化和对金属基质蛋白酶(MMP)及其抑制物的影响. 方法 传代培养HSC-T6细胞,分空白对照组、HB-EGF处理组(20,40,80 ng/mL),采用QRT-PCR法检测MMP-2、金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)及表皮生长因子受体(EGFR) mRNA的表达,并确定HB-EGF刺激HSC-T6 Ras/ERK通路(ERK1、ERK2、P38MAPK)活化的最佳浓度及最佳时间,检测该通路活化情况. 结果 QRT PCR检测提示,MMP-2的表达随HB-EGF干预时间的延长增加,TIMP-1的表达随干预时间的延长递减;40 ng/mL HB-EGF培养HSC-T6 48 h后,EGFRmRNA的表达较空白对照组明显上调(P＜0.05);选择40 ng/mL HB-EGF培养48 h为最佳刺激时间与浓度,该处理组ERK1 mRNA的表达较空白对照组明显上调(P＜0.05),但ERK2、P38MAPK的变化无统计学意义;Western-blot检测提示该处理组ERK1蛋白的表达较空白对照组上调(P＜0.05). 结论 HB-EGF可影响HSC-T6的MMP-2、TIMP-1的表达;HB-EGF通过促进HSC-T6表达EGFR、ERK1,有效激活细胞内Ras/ERK信号通路.     

肝素结合表皮生长因子及其在动脉粥样硬化中的相关研究进展

肝素结合表皮生长因子（heparin-binding epidermal growth fac-tor-like growth factor,HB-EGF）是表皮生长因子（EGF）家族成员之一,作为多种细胞的有丝分裂原,以自分泌、旁分泌、邻分泌作用形式广泛参与人体生理及病理过程,在动脉粥样硬化（atheroscle-rosis,AS）中亦涉及一系列重要生理病理反应。现将HB-EGF结构、作用机制和在AS中的研究进展综述如下。     

金属蛋白酶多抗原表位DNA疫苗诱导免疫应答的研究

目的研究信号肽在真核表达系统中对金属蛋白酶多抗原表位DNA疫苗诱导小鼠免疫应答影响。方法人工合成含有金属蛋白酶多个抗原表位的DNA序列,将连接信号肽与不连接信号肽的该序列分别连接pIRESneo表达载体,构建的2种质粒免疫小鼠,ELISA法、出血中和法检测免疫后效价。结果 2种质粒诱导小鼠产生的抗体效价10-2为阳性,均能有效减轻金属蛋白酶引起的出血。结论信号肽的有无对金属蛋白酶DNA疫苗在小鼠体内表达没有影响。     

小鼠分泌型IL-1β真核表达载体的构建及其表达

目的:构建小鼠经典分泌途径IL-1β真核表达载体,转染至Hepa1-6细胞,并测定其分泌表达水平.方法:引物延伸获得小鼠AFP信号肽序列(sAFP),RT-PCR扩增获得小鼠IL-1β成熟蛋白基因序列(mIL-1β),SOE方法将两段序列拼接形成融合基因,与pIRES2-EGFP质粒重组构建分泌型真核表达载体pIRES2-EGFP-smIL-1β,并将其转染至Hepa1-6细胞,RT-PCR检测融合基因的表达水平,'Western blot检测细胞内mIL-1β蛋白的表达,ELISA法测定培养上清及细胞裂解液中mIL-1β水平.结果:经SOE法拼接获得的融合基因与CenBank中登录的序列一致,RT-PCR检测显示该载体能够在Hepal-6细胞中表达融合基因mRNA,细胞培养上清中mIL-1β的分泌水平明显上升,而胞质中的mIL-1β无明显变化.结论:成功地构建了经典途径分泌的mIL-1β重组表达载体,该载体可以在Hepa1-6细胞培养上清中有效分泌具有生物活性的mIL-1β.