中国庚型肝炎病毒河南株非结构基因（NS）3区cDNA的克隆 …

目的 为了研究中国庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）非结构（ＮＳ３）区基因结构特征。方法 利用逆转录－半巢式－聚合酶链反应从河南１份ＨＧＶ ＲＮＡ阳性血清获得覆盖ＨＢＶ ＮＳ３全长ｃＤＮＡ的４个片段，并克隆到ｐｃＤＮＡⅡ载体中，采用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧末端终止法测定全部ｃＤＮＡ序列。结果 发现克隆到的包括ＨＢＶ ＮＳ３区在内的ｃＤＮＡ序列和度为２１３７个核苷酸，编码７１１个氨基酸。与国内外已测定的５株全序列的相     

应用长链RT-PCR法扩增我国登革2、4型病毒株全长cDNA

目的：采用长链RT-PCR技术扩增登革2型及4型病毒基因组全长cDNA，为构建登革病毒全长cDNA克隆、表达，深入阐明致病机理及探索新型疫苗奠定基础。方法：根据已测定的登革2、4型病毒全基因组序列，设计上下游引物。从感染登革病毒的乳鼠脑中提取病毒基因组RNA，采用长链RT-PCR技术进行扩增。为检验扩增产物的特异性，以PCR产物为模板扩增覆盖基因组的10个片段。将含有复杂二级结构的5′非编码区扩增片段，在377A型自动测序仪进行序列分析。结果：扩增出登革2、4型病毒基因组全长近11kb cDNA分子，非编码区测序结果表明扩增产物为登革2、4型病毒所特有。结论：利用长链RT-PCR首次成功扩增出登革病毒全长cDNA分子。     

人类一条新的类蛋白质二硫键异构酶cDNA的克隆和表达

利用SMART技术构建了人胎脑cDNA文库，通过大规模测序筛选出一条1645bp的人类cDNA。此cDNA含有一个888bp的开放阅读框（ORF），编码一个296个氨基酸的蛋白质，预测分子量34．0KD。与目前数据库中序列比较，该cDNA编码的蛋白质与蛋白质二硫键异构酶的同源性达36％，命名为类蛋白质二硫键异构酶（PDI－L）基因，多组织Northern blot分析显示PDI－L cDNA在心、脑、肝肾等组织中均有表达，该cDNA的读框片段正确插入到改造后的pBV220表达载体中，获得了预期的表达蛋白。     

藏羚羊大脑皮质cDNA文库的构建

目的:构建藏羚羊大脑皮质组织的cDNA文库并鉴定文库质量。方法:提取藏羚羊大脑皮质组织总RNA,经oli-gotex试剂盒纯化得到mRNA。利用SMART技术,使用含有SfiIB酶切位点的oligo(dT)引物和含有SfiIA酶切位点的SMARTIV寡核苷酸在PowerScript逆转录酶作用下运用mRNA5′末端的模板转换方法合成cDNA第1链。利用LDPCR扩增cDNA,经SfiI(ⅠA和ⅠB)酶切后,通过CHROMASPIN-400柱进行分级分离去除<500bp的片段,再同经SfiI酶切的λTripIEx2载体连接,体外包装后转染到大肠杆菌XL1-Blue宿主菌中,进行文库滴度和重组率的测定,然后扩增文库并随机挑取10个噬菌斑行PCR反应鉴定插入片段大小。结果:构建的cDNA文库滴度为1.8×109pfu/L,重组率>98%,文库扩增后滴度达8×1012pfu/L,插入片段长度在750～6000bp之间,平均长度为4250bp。结论:文库具有良好的质量,为进一步筛选、克隆藏羚羊大脑皮质组织特异表达基因奠定了基础。     

中国人群D4S10区DNA多态性研究及其在Huntington舞蹈病遗传咨询中的意义

本文应用pTV20探针研究了人类基因组D_4S10区的DNA片段长度多态性在中国人群中的分布及其在Huntington舞蹈病(HC)遗传咨询中的意义。结果表明:在中国人群中存在着2.3kb(a)和3.5K(b)两个DNA多志性片段,其中a占36.54％,b占63.46％;a/a型个体占11.54％、b/b型个体占38.46％,a/b杂合子占50％。两个HC家系的分析结果表明,该DNA多志性标记与HC基因呈连锁状态,在某些家系中可进行HC的症状前诊断。     

探针ASPCR检测肺炎支原体 微量耐药突变A2063G方法的建立

[摘要]　目的　 建立能够特异性检测微量肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae, MP）A2063G耐药突变基因的特异性扩增等位基因的探针法实时定量PCR（probe-based allele-specific real-time PCR, 探针ASPCR）方法。方法?建立特异性检测A2063G耐药突变位点的探针ASPCR方法,并验证其灵敏度、特异度及准确度等性能。结果?特异性扩增2063G和非特异性扩增2063A/G的引物/探针组合分别扩增105拷贝野生基因型（2063A）模板的Ct值的差(△Ct)高达10.93,能够特异性检测A2063G突变。探针ASPCR方法检测2063G基因型占总MP的比例的准确度可低至1％;检测MP的灵敏度低至10拷贝,检测A2063G耐药突变比例的灵敏度低至0.01％。探针ASPCR方法与前期建立的染料ASPCR方法检测临床样本的MP感染结果一致,MP阳性检出率均为94.83%（55/58）,高于传统巣式PCR联合测序方法的检测结果（75.86%,44/58）;探针ASPCR和染料ASPCR 2种方法检测MP耐药率分别为63.64%（35/55）、70.91%（39/55）,高于传统巣式PCR联合测序方法检测结果59.09%（26/44）。结论?新建探针ASPCR方法是一种具有高特异度、准确度和灵敏度的快速检测MP微量A2063G耐药突变的方法;与染料ASPCR方法相比,探针ASPCR方法检测耐药MP的灵敏度略低,但其临床样本检测复查率也低于染料ASPCR方法,且其结果判读简单,更适合在临床中应用推广,能够为临床制定MP及耐药MP感染的治疗方案提供理论依据。     

多重不对称PCR探针熔解曲线法在一管中检测多个肥胖易感基因方法的建立

目的 针对中国人群4个常见的肥胖易感基因位点(FTO基因rs1421085位点、APOA5基因rs662799位点、FABP2基因rs1799883位点、ADRB3基因rs4994位点),建立一种方便、精准、低成本的检测方法.方法 结合前期研究中发现的与中国人群肥胖密切相关的4个基因位点,设计引物对、荧光探针以及对应等位基因的靶序列,通过熔解曲线法,验证荧光探针与对应等位基因的靶序列的工作效果,确认不同基因型的熔解温度.采用PCR-Sanger测序法为金标准,对收集的人唾液样本进行检测,选取12个基因型的样本,开发多重不对称PCR荧光探针熔解曲线法进行检测.随后,使用多重不对称PCR探针熔解曲线法与PCR-Sanger测序法分别对200例志愿者的唾液样本进行基因分型检测,比较两种方法的结果与优缺点.结果 多重不对称PCR探针熔解曲线法可以在一管中同时对4个常见的肥胖易感基因位点进行检测,准确度与PCR-Sanger测序法相同,且与PCR-Sanger测序法需有扩增、电泳、纯化、s测序的复杂步骤相比,可在一管中一次完成检测,操作更为便捷,且成本更加节省.结论 本研究建立了一种针对4个常见肥胖易感基因位点的方便、精准、低成本的基因分型方法,为人群肥胖易感基因的批量筛查提供了一种有效的检测手段.     

人白细胞介素18（hIL—18）的cDNA基因克隆及序列测定

目的：克隆人白细胞介素18（IL－18）全长cDNA基因,进一步探讨人白细胞介素18的功效。方法：采用RT－PCR的方法从人肝组织中扩增出人白细胞介素18（IL－18）基因,并克隆到真核表达的绿色荧光蛋白报告载体pEGFP-NI中,结果：经PCR及DNA序列测定得以证实其序列与文献报导一致,结论：该实验成功地克隆了IL－18cDNA,并将其重组构建了含有IL－18cDNA的真核表达载体pEGFP-N1-IL18。     

乙型肝炎病毒检测方法比较与临床意义

目的：对FQ－PCR与常规PCR和探针斑点杂交的灵敏性比较及临床应用。方法：采用FQ－PCR与常规PCR和探针斑点杂交三种方法检测HBV－DNA。结果：在156例乙型病毒性肝炎中,FQ－PCR的检出率是93．59％（146／156）,常规PCR为76．28％（119／156）,探针斑点杂交为71．80％（112／156）。FQ－PCR显高于常规PCR及探针斑点杂交,P值均＜0．05）。结论：FQ－PCR有灵敏,特异,简便的优点,它能为临床疗效观察提供直接的指标。     

金黄色葡萄球菌norA基因探针的制备

目的　研究制备 nor A基因介导的金黄色葡萄球菌对氟喹诺酮类药物的耐药机制的 Dig- nor A基因探针。方法　采用聚合酶链反应 (PCR)制备 Dig- nor A基因探针。结果　 PCR法制备 Dig- nor A基因探针简便易行 ,可在较短时间内获得大量的探针 ,所得探针有较高的敏感性 ;Dig- nor A基因探针安全、易操作 ,标记探针可长期保存。结论　为进一步研究 nor A基因介导的耐药机制提供了一种手段