反义寡核苷酸抑制survivin基因表达及肝癌细胞生长的研究

目的:采用反义寡核苷酸抑制肝癌细胞中survivin基因的表达,研究其对肝癌细胞生长的作用.方法:采用脂质体介导survivin反义寡核苷酸转染人肝癌细胞株SMMC-7721细胞,Western blot及原位杂交方法检测survivin蛋白及mRNA表达,流式细胞仪检测凋亡细胞比率,检测转染前后细胞贴壁率变化,并绘制细胞生长曲线.结果:survivin反义寡核苷酸转染后,肝癌细胞survivin蛋白及mRNA表达均显著降低,细胞贴壁率显著降低,细胞增殖活性明显受抑,细胞凋亡率显著增加.结论:survivin反义寡核苷酸转染可以有效降低细胞内survivin基因的表达,诱导细胞发生凋亡,抑制肝癌细胞生长.     

Lipofectin介导bcl-xL反义寡核苷酸抑制鼻咽癌细胞增殖活性的研究

目的　观察并探讨阳离子脂质体 (L ipofectin,L ip)介导的 bcl- x L 反义寡核苷酸 (antisenseoligodeoxynucletide,ASODN)对鼻咽癌细胞株 CNE- 1、CNE- 2 Z细胞体外抑制增殖活性的影响。方法　人工合成硫代修饰型 bcl- x L 反义寡核苷酸 (ASODN) ,与 L ip混合制备成 L ip+oligodeoxynucletide(ODN)复合物 ,处理鼻咽癌细胞株 CNE- 1、CNE- 2 Z细胞 ,用 MTT比色法检测细胞存活状态 ;流式细胞术检测细胞凋亡。结果　 ASODN处理细胞 3 6小时 ,于 40 0 μm ol/ L 浓度条件下鼻咽癌细胞的增殖受到明显抑制 ,且这一抑制作用随着浓度的增加与时间的延长而加强 ,与硫代修饰型随机序列对照寡核苷酸 (sequence control ODN,SCODN)组及单独脂质体组比较 ,差异有显著性 (P<0 .0 5 )。结论　 bcl- x L 反义寡核苷酸可显著抑制鼻咽癌细胞株 CNE- 1、CNE- 2 Z细胞体外增殖活性 ,其抑制作用可能通过封闭 bcl- x L 基因表达实现 ,bcl- x L 反义寡核苷酸有可能成为一种潜在性的基因治疗药物用于鼻咽癌的治疗     

c-raf-1反义寡核苷酸对人卵巢癌细胞放射敏感性的影响

目的　探讨癌基因 c- raf- 1的反义寡核苷酸对人卵巢癌细胞放射敏感性的影响。方法　设立 c- raf- 1正义寡核苷酸组和非处理组 (仅加入等量的脂质体 )作对照 ,用 RT- PCR检测卵巢癌细胞处理前后 c- raf- 1表达水平的变化。用平板克隆形成试验检测人卵巢癌细胞株 SKOV3在脂质体 - c- raf- 1反义寡核苷酸作用前后受 6 0 Coγ射线不同剂量照射后的集落形成率。结果　 c- raf- 1反义寡核苷酸能抑制 c- raf- 1癌基因的表达 ,经脂质体介导的 c- raf- 1反义寡核苷酸作用的卵巢癌细胞经γ射线照射后其集落形成率较转染正义寡核苷酸组及单纯照射组明显下降 (P<0 .0 1) ,而转染 c- raf- 1正义寡核苷酸组的集落形成率与单纯照射组相比无明显差异 (P>0 .0 5 )。结论　 c- raf- 1反义寡核苷酸通过抑制 c- raf- 1的表达降低人卵巢癌细胞株 SKOV 3放射抗拒性。该作用可能与 c- raf- 1反义寡核苷酸抑制了引起细胞辐射抗拒的细胞信号转导途径有关     

BRCA1基因反义寡核苷酸对人骨肉瘤细胞的影响

 目的　探索抑癌基因BRCA1基因反义寡核苷酸对人骨肉瘤细胞SOSP 96 0 7的影响。方法　通过细胞培养 ,测量细胞生长曲线、计算细胞集落形成率、检测细胞周期等 ,观察BRCA1基因反义寡核苷酸对人骨肉瘤细胞系SOSP 96 0 7的影响。结果　BRCA1基因反义寡核苷酸浓度为 1 0 μmol/L时 ,骨肉瘤细胞的生长速度变快 ,集落形成率明显增高 ;流式细胞仪检测发现其引起细胞周期变化 ,细胞增殖活性提高。结论　BRCA1基因反义寡核苷酸对人骨肉瘤细胞SOSP 96 0 7有明显的影响 ,使得骨肉瘤细胞恶性生物学特性更加显著 ,提示BRCA1基因在人骨肉瘤发展过程中起作用     

Survivin反义RNA真核表达载体的构建及鉴定

目的 为了特异封闭白血病细胞survivin的表达，抑制其功能，本实验构建了survivin反义核酸载体并导入白血病细胞系中。方法 应用RT—PCR获得survivin的cDNA片段，反向插入pcDNA3质粒载体中；经限制性酶切和测序鉴定所构建的反义核酸是否正确；采用电转染方法将重组体导入HL—60细胞中；RT—PCR技术检测转染细胞survivin表达的变化。结果 经限制性酶切和测序鉴定证明survivin反义核酸已成功构建；RT—PCR产物电泳结果显示，与转染前细胞、空质粒转染细胞相比，转染survivin反义核酸的细胞survivin mRNA水平明显降低。结论 本实验已成功建立了survivin反义核酸真核表达载体，而且在白血病细胞系中发挥了特异封闭作用，为进一步研究survivin反义核酸在白血病治疗中的作用提供了实验基础。     

反义核酸抑制胃癌细胞Bcl-2表达

本文采用分子克隆技术成功地构建了反义核酸表达载体pDOR-Bcl-2 cDNA.以脂质体介导法将重组反义核酸表达载体转染受体细胞SGC7901,并经C418筛选,从2×10~5细胞中筛选出大约150个抗性克隆,转导率大于1‰,随机挑选2个克隆继续筛选与扩增培养,获得了1株稳定的抗性细胞,从而建立了Bcl-2表达阻断的胃癌细胞株,我们命名为7901anBcl-2 cells.通过Southern印迹法、Northern印迹法、Western印迹法检测显示,转导株与非转导株均有Bcl-2 cDNA的表达,但转导株Bcl-2 mRNA及蛋白的表达明显低于非转导株.说明在胃癌细胞中Bcl-2基因处于高表达状态,通过真核表达载体介导的转染,反义Bcl-2可成功地导入胃癌细胞,并有效地阻断Bcl-2表达.     

嵌合性启动子HRE.CArG的构建及对肝癌细胞乏氧和射线应答的调控

实体瘤中乏氧区的存在是影响放疗效果最主要的因素之一[1].在一个基因启动子内利用乏氧和射线应答元件联合,限制治疗基因仅在乏氧和/或受照组织激活,可提高治疗比率.该文研究目的是构建包含HREs和CArG元件的乏氧-辐射嵌合性基因启动子,并观察乏氧及照射时该启动子诱导增强的绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)在BEL7402肝癌细胞中的表达变化.     

层黏连蛋白受体反义核酸对卵巢癌细胞侵袭能力的影响

目的:研究67 kD层黏连蛋白受体(67kDLN-R)反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASODN)对卵巢癌细胞HRA体外侵袭转移能力的影响.方法:采用流式细胞仪、RT-PCR及Transwell小室的方法检测反义核酸对67 kD LN-R基因和蛋白表达影响,及转染前后细胞体外侵袭转移能力变化.结果:67 kD LN-R ASODN可从蛋白质和mRNA水平下调67kDLN-R的表达,且下调作用呈剂量依赖性.与正义组及对照组相比差异有显著性(P＜0.05).体外侵袭实验证实转染后HRA穿透人工基底膜的能力显著降低并呈现剂量依赖性.结论:67kDLN-R ASODN可降卵巢癌细胞体外侵袭转移能力,有望为卵巢癌治疗提供新方向.     

反义寡核苷酸对人视网膜色素上皮细胞EGFR表达的影响

目的　研究反义寡核苷酸 (ODN)对人视网膜色素上皮 (RPE)细胞表皮生长因子受体 (EGFR)表达的影响。方法　采用人工合成反义ODN经阳性脂质体包裹后转染人RPE细胞。采用半定量RT PCR法与ELISA法检测EGFRmRNA及蛋白的表达水平。结果　显示转染反义ODN 2 4h后 ,EGFRmRNA的表达抑制率为 35 .2 % ,EGFR蛋白抑制率为 6 6 .4 5 % .4 8h后 ,反义EGFRODNs对EGFR的表达抑制作用消失。结论　EGFR反义ODN可抑制人视网膜色素上皮细胞的EGFRmRNA及其蛋白的表达。     

肺癌组织MMP-7表达及其反义寡核苷酸对肺腺癌A549细胞增殖的作用

目的 检测非小细胞肺癌患者基质溶解素（matrilysin，MMP-7）的表达，探讨重组基质溶解素（rMMP-7）和脂质体-MMP-7反义寡核苷酸（antisense oligonucleotde of matrilysin by liposome transfection，LIPO-MAON）对肺腺癌A549细胞和人脐静脉血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）增殖的影响。方法 ①免疫组化法检测NSCLC患者癌组织MMP-7表达；②MMT法和半定量RT-PCR法检测rMMP-7和LIPO-MOAN作用下A549和HUVEC的增殖及MMP-7-mRNA表达。结果 57例肺癌组织47例MMP-7表达为阳性，阳性表达率为82．5％，与正常对照组相比P〈0．01。rMMP-7能促进肺腺癌A549细胞的增殖，LIPO-MAON对AM9细胞增殖则有明显抑制作用。对HUVEC增殖，仅高浓度的rMMP-7（0．75、1．0μg／ml）有促进作用，而LIPO—MAON对其增殖无抑制作用。RT-PCR结果表明，HUVEC不表达MMP-7-mRNA；rMMP-7能增加A549细胞MMP-7-mRNA的表达，LIPO-MAON可降低其表达（P〈0．05）。结论 非小细胞肺癌患者MMP-7表达阳性率为82．5％，MMP-7反义寡核苷酸能抑制肺腺癌细胞的增殖及MMP-7-mRNA表达，对正常血管内皮细胞增殖无抑制作用。MMP-7能促进肺腺癌细胞增殖。