血清促红细胞生成素的双抗体夹心ELISA法和ELISA试剂盒的建立及其方法学研究

目的建立血清促红细胞生成素（EPO）的EUSA试剂盒及一种检测血清EPO的双抗体夹心ELISA方法,并对其临床检测方法学进行研究。方法EPO抗体用缓冲液稀释,150μL/孔滴加到96孔板,用以包被。以正常人血清和临床血清为标本,用ELISA法观察其灵敏度、回收率、线性试验、稳定性。结果最佳包被抗体浓度为1：600,最佳抗原工作浓度为1：100,酶标抗体工作浓度为1：5000。标准曲线的回归方程为：y=0．017x＋0．3002,r=0．9710,P〈0．05。灵敏度为0．46U／L,高、低浓度样品平均回收率分别为106．74％、104．78％。血清标本20、80U/L批内变异分别为3.044％、7．964％,批间变异分别为1．379％、12．915％。结论双抗体夹心ELISA法检测血清EPO,其敏感性、特异性、准确度均良好,为临床快速、准确、方便检测EPO提供了实验依据．     

Excel、SPSS拟合血清乙型肝炎病毒大蛋白浓度标准曲线的效果比较

目的考察SPSS和Excel对血清乙型肝炎病毒（HBV）大蛋白（—LP）浓度标准曲线的拟合效果。方法HBV—LP标准品吸光度检测采用酶联免疫吸附试验．分别用SPSS软件曲线估计和Excel软件规划求解对HBV—LP标准品浓度与吸光度进行线性模型、对数线性模型、二次多项式模型、三次多项式模型的曲线拟合,比较两种拟合方法的各回归模型拟合效果的一致性。并根据各回归模型决定系数的大小来优选血清HBV—LP浓度标准曲线回归模型。结果HBV—LP标准品浓度与吸光度的散点图呈非线性趋势;两种拟合方法的线性模型、对数线性模型、二次多项式模型、三次多项式模型的回归方程均有意义（P〈0．001）,其决定系数小数点后四位是一致的：其中二次多项式模型、三次多项式模型的拟合精度较高,决定系数均大于0．95。结论Excel软件规划求解拟合血清HBV—LP浓度标准曲线的效果与SPSS高度一致．是一种临床实验室定量标准曲线拟合与优选的有效方法。     

过敏原特异性T细胞检测方法的研究进展

【摘要】 追踪T细胞数量和功能的变化在临床诊断和评估过敏原免疫治疗疗效等方面具有重要的参考价值。本文综述了羧基荧光素琥珀碱亚胺酯连续稀释法、酶联免疫斑点检测法、胞内细胞因子染色法和微阵列免疫传感器等过敏原特异性T细胞检测方法和临床应用的研究进展,为选择和发展合适的检测方法并应用于临床提供参考。     

抗CD3单抗包被技术获得CD3AK细胞的体外实验研究

目的 抗CD3单抗包被技术与传统方法培养获得的抗CD3单克隆抗体激活的杀伤细胞(anti-CD3monoclonal antibody activated killer cells,CD3AK)、细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cells,CIK)的体外扩增、体外杀伤活性及免疫表型的比较,以期为选择增殖更快、抗癌效应更强的生物活性细胞供临床治疗.方法 健康人外周血单个核细胞,分别采用抗CD3单抗包被技术与传统方法培养获得CD3AK细胞、常规方法培养获得CIK细胞,检测各免疫活性细胞对K562耐药细胞株(K562/ADR)的杀伤活性、细胞膜P-糖蛋白(P-glucoproteins,P-gP)表达以及收获时细胞表型、上清液细胞因子含量.结果 培养第13天时,包被技术获得CD3AK细胞和CIK细胞计数分别为非包被培养的1.41倍、2.96倍;3组细胞免疫表型差异均无统计学意义(P＜0.05);但上清液中白细胞介素2(1L-2)水平3组分别为(47.97±3.24)ng/L vs(40.14士2.26)ng/L vs(35.90士3.33)ng/L,IL-12为(128.50±14.82)ng/L vs(110.69±10.02)ng/L vs(98.24±10.30)ng/L,肿瘤坏死因子α(TNF-α)为(154.42±16.99)ng/Lvs(143.67±14.24)ng/L vs(121.56土13.62)ng/L,γ干扰素(IFN-γ)为(143.79±12.97)ng/L vs(115.87士13.24)ng/L vs(102.50土10.47)ng/L,包被培养CD3AK细胞组高于其他两组(P＜0.05).3组细胞在不同效价比对K562/ADR细胞杀伤活性差异无统计学意义(P＞0.05),与K562/ADR细胞作用后P-gP蛋白表达均下调,但差异无统计学意义(P＞0.05).结论 抗CD3单抗包被技术可以在短时间内获得更大数量的免疫活性细胞,抗肿瘤细胞活性肯定,是一种更为有效的培养方式.     

重组血型改造工具酶稳定性的研究

目的研究血型改造工具酶,重组咖啡豆α-半乳糖苷酶在不同保存条件下的稳定性。方法以酶解B型红细胞的活性和纯度作为主要检测指标,考察重组α-半乳糖苷酶的热稳定性。重组α-半乳糖苷酶在70℃条件下保存1d,37℃保存60d,室温、4、-20、-70℃分别保存6个月,定期取样观察样品的外观,检测样品的pH值、纯度、酶活性,并进行无菌试验;为确保临床使用中的安全性和有效性,我们对4℃保存的样品进行了长达3年的观察。结果重组α-半乳糖苷酶在70℃保存1d后失活,37℃保存2个月后活性降低了11.5%,室温保存6个月后活性降低了19%,-70℃保存6个月后活性降低了13%,4℃、-20℃保存的样品6个月内各项指标均正常,均未见蛋白明显降解,蛋白活性保持稳定。4℃保存3年的样品酶活性保持稳定,可按原剂量在26℃,2h内成功地将B型红细胞改造成O型红细胞。结论重组α-半乳糖苷酶对热不稳定,应保存4℃或-20℃,在此条件下,有效期至少2年,能满足常规临床要求。     

核酸扩增及微流芯片技术在献血者HCV筛查中的应用

目的 应用核酸扩增和微流芯片分析方法,用于献血者血液标本丙型肝炎病毒(HCV)的检测.方法 选取80份疑似HCV感染的血液标本,分别采用2种ELISA法、胶体金法、化学发光免疫分析(CLIA)法和核酸扩增后微流芯片法分析.结果 经过核酸扩增的HCV阳性血液经分析后皆出现预期大小片段的特异性条带,而阴性血液缺少相应的条带...     

国产乙型肝炎病毒表面抗原酶联免疫吸附试验试剂盒的检测效果评价

目的:评价6种国产乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒的检测效果。方法:应用AXSYM全自动微粒子酶免疫化学发光分析仪检测测定后余留标本,对相关样品进行稀释,然后选取6种国产HBsAgELISA试剂盒进行检测,评价6种国产试剂盒的灵敏度、精密度、特异度、检测范围和钩状效应(Hook效应),确立临界值(cut-off)对应的浓度范围以及不同孵育时间对检测灵敏度的影响等。结果:6种试剂盒的灵敏度有一定差异,范围在0.40～0.60ng/mL之间。对低浓度标本,6种试剂盒的批内精密度变异系数(CV)分别为6.21%、9.45%、9.42%、13.04%、10.49%和4.84%;批间精密度CV分别为15.76%、19.12%、19.54%、23.89%、24.22%和14.99%。HBsAg质量浓度与临界值指数(COI)呈S型曲线关系。在本实验所分析的HBsAg浓度范围内未发现高剂量Hook效应。6种试剂盒临界值对应的质量浓度在0.3～0.5ng/mL之间。结论:国产HBsAgELISA试剂盒的灵敏度有待进一步提高。     

衰老可导致间充质干细胞氧化损伤修复能力降低

背景：DNA损伤及损伤后的应答异常会导致基因组不稳定,基因组不稳定是肿瘤形成的重要因素之一。在细胞衰老过程中,衰老细胞基因组稳定性下降,对于端粒、端粒酶的研究以及对于原癌基因和抑癌基因的研究,表明细胞衰老和肿瘤有密切的联系。目的：以氧化损伤为模型,探索DNA损伤应答异常是衰老细胞基因组不稳定性的直接原因。方法：培养骨髓间充质干细胞,流式细胞术进行检测鉴定。衰老相关β-半乳糖苷酶检测细胞衰老情况,BrdU掺入实验检测细胞增殖情况。建立体外培养人间充质干细胞衰老模型,通过CCK-8法检测细胞存活情况,DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧,单细胞凝胶电泳观察细胞DNA损伤情况。结果与结论：人间充质干细胞经长期培养发生衰老,培养40代以后,衰老相关β-半乳糖苷酶染色阳性细胞明显增多,BrdU掺入能力显著下降,提示间充质干细胞长期培养后发生衰老。生存曲线结果显示H2O2作用下,年轻间充质干细胞存活率明显高于衰老间充质干细胞;活性氧及单细胞凝胶电泳结果显示,H2O2处理后衰老间充质干细胞DNA损伤更严重,修复时间更长,说明衰老间充质干细胞比年轻间充质干细胞对H2O2损伤更为敏感。     

腺病毒介导的人骨形态发生蛋白2基因转染骨髓间充质干细胞

背景：骨髓间充质干细胞作为骨、软骨创伤缺损及退变修复的种子细胞越来越受到关注。目的：分析人骨形态发生蛋白2基因转染对白色封闭群大鼠（SD大鼠）骨髓间充质干细胞的影响。方法：分离纯化SD大鼠骨髓间充质干细胞并体外扩增,通过腺病毒载体介导人骨形态发生蛋白2基因转染骨髓间充质干细胞,分别通过荧光显微镜观察荧光表达情况及蛋白质水平来测定转染后人骨形态发生蛋白2的表达,碱性磷酸酶定量测定鉴定成骨活性及MTT法评估人骨形态发生蛋白2转染对骨髓间充质干细胞的影响。结果与结论：从SD大鼠骨髓提取物中分离培养的细胞形态为梭形,呈铺路石状、漩涡状生长,经流式细胞仪检测及多项分化能力鉴定符合骨髓间充质干细胞的特征;经转染人骨形态发生蛋白2基因后,骨髓间充质干细胞表达人骨形态发生蛋白2、碱性磷酸酶;MTT法检测转染人骨形态发生蛋白2基因后,骨髓间充质干细胞增殖能力明显增强（P〈0．05）。说明人骨形态发生蛋白2基因转染骨髓间充质干细胞后可以持续、高效表达入骨形态发生蛋白2和碱性磷酸酶,在体外明显促进骨髓间充质干细胞的增殖。     

AP-2α对基质金属蛋白酶-20作用的研究

目的:通过研究AP-2α转录因子对基质金属蛋白酶-20(matrix metalloproteinase-20,MMP-20)基因表达的调控作用,进一步明确AP-2α的功能,为研究AP-2α在釉质形成中的作用奠定基础。方法:利用RT-PCR法、双荧光素酶报告基因检测系统、染色体免疫共沉淀技术等来分析AP-2α与MMP-20启动子区域的转录调控能力。结果:小鼠成釉细胞转染AP-2αsiRNA后,成釉细胞中MMP-20 mRNA的表达水平显著上调。染色体免疫共沉淀结果显示,AP-2α可能通过与MMP-20启动子特征性序列相互作用,从而调控MMP-20的表达。双荧光素酶报告基因检测显示预测结合位点突变后,AP-2α对MMP-20启动子的表达水平无显著影响。结论:AP-2α基因沉默可显著上调MMP-20的mRNA表达水平;而AP-2α过表达可显著抑制MMP-20活性。提示AP-2α转录因子与成釉细胞内MMP-20启动子的特征性序列相互作用,从而调控MMP-20的表达水平。