谷胱苷肽转移酶抑制剂高通量筛选模型的建立和初步应用

谷胱苷肽 - S-转移酶 -π( GST-π)的活性在某些类型的癌症患者中有显著的升高并且在癌症细胞对抗癌药物抗药性的形成过程中起着重要的作用。抑制过量表达的 GST-π酶的活性将有助于克服肿瘤细胞的耐药性 ,因此 ,GST-π被认为是一个潜在的药物作用的靶位点。为了筛选新的抗癌药物的增敏剂 ,我们建立了一个 GST-π酶抑制剂的高通量筛选模型 ,该模型以 CDNB和 GSH为底物 ,在 96 -孔板上通过对 340 nm处吸光度的变化来检测样品对 GST-π酶的抑制活性。经过初筛和复筛 ,从 4 80 0个微生物发酵提取物中筛选到10个阳性样品 ,阳性率为 0 .2 %。     

人单核巨噬细胞泡沫化抑制剂筛选模型的建立及应用

目的: 建立人单核巨噬细胞泡沫化抑制剂筛选模型,筛选得到可抑制细胞泡沫化的抑制剂.方法: U937单核细胞经100 nmol·L-1佛波酯(PMA)诱导72 h分化为巨噬细胞后,换无血清培养液于96孔板中,每毫升含巨噬细胞1×106个,每孔再加入80 mg·L-1氧化的低密度脂蛋白(ox-LDL),37 ℃培养48 h,建立单核巨噬细胞泡沫化模型.利用微生物发酵液,或单一的化合物样品与其共孵育,油红.染色后观察细胞胞内变化,寻找对泡沫细胞形成有抑制作用的样品.利用基因工程技术表达的人清道夫受体A类II型的胞外部分,在本模型中可抑制巨噬细胞泡沫化的形成,进一步验证了模型的可行性.结果: 从2000 个微生物发酵液中筛选到6株微生物发酵液为阳性,从10个化合物中发现一个有抑制巨噬细胞泡沫化活性的新化合物.结论: 本模型可用于细胞泡沫化抑制剂的高通量筛选.     

鼻内翻性乳头状瘤及其癌变与p53蛋白异常表达

目的：探讨鼻内翻性乳头状瘤及其癌变与ｐ５３基因的关系。方法：采用免疫组化方法（ＡＢＣ法）对３６例鼻内翻性乳头状瘤（ＩＰ）组织和１６例鼻内翻性乳头状瘤癌变（ＩＰ＋ＳＣＣ）组织进行了ｐ５３蛋白检测。结果：３６例ＩＰ均为ｐ５３蛋白阴性，而在１６例ＩＰ＋ＳＣＣ组织中有５例为ｐ５３蛋白阳性，阳性率为３１．３％（５／１６），经统计学处理，二者差异显著（Ｐ〈０．００１）。结论：ｐ５３蛋白异常表达可能与ＩＰ的发生     

氯化镉诱发16HBE细胞系恶性转化过程中TIF3 p36的变化

目的 探讨氯化镉诱发人支气管上皮细胞（16HBE）恶性转化过程中不同阶段蛋白翻译起始因子（TIF3）p36 mRNA表达水平的变化,为进一步阐明氯化镉的分子致癌机制提供线索.方法 应用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术,以及敏感先进的Taqman荧光定量PCR方法,检测并分析氯化镉诱发16HBE恶性转化不同阶段即转化期间细胞、转化细胞和成瘤细胞的TIF3 p36 mRNA表达量的变化.结果 相对于非转化对照细胞（16HBE）,氯化镉诱发恶性转化不同阶段细胞（转化期间细胞、转化细胞和成瘤细胞）的TIF3 p36 mRNA基因表达水平均明显升高（P＜0.01或P＜0.05）,其中低剂量组（5 μmol/L）所转化的各阶段细胞的eIF3 p36 mRNA平均表达量分别是对照细胞的3.1、5.9和9.9倍,中剂量组（10 μmol/L）的各阶段转化细胞的TIF3平均表达量分别是对照细胞的7.1、6.8和14.8倍,高剂量组（15 μmol/L）的各阶段转化细胞的TIF3 p36平均表达量分别是对照细胞的3.6、3.0和9.1倍.这些不同剂量组的研究结果提示,eIF3 p36的异常表达量与氯化镉诱发16HBE细胞恶变程度之间有正相关关系,但与镉的剂量无关.结论 氯化镉在诱发16HBE细胞恶变过程中,存在明显的蛋白翻译启动因子eIF3 p36异常表达现象,其表达水平与细胞的恶变程度密切相关,这可能是氯化镉诱发人细胞肿瘤的重要分子致癌机制之一.     

人源性中性内肽酶稳定转染细胞株的建立

目的：获得中性内肽酶（NEP）及失活中性内肽酶（inNEP）稳定表达的细胞株。方法：用酶切及基因测序鉴定质粒pcDNA3．1-hNEP及pcDNA3．1-inNEP（E585V）；以脂质体Ljpofectamjne^TM2000介导pcDNA3．1-hNEP及pcDNA3．1-inNEP（E585V）转染神经母细胞瘤细胞SK-N-SH，分别获得两者的稳定表达细胞株；用RT-PCR及Western blot分析NEP的表达。结果：转染4周后，可见G418单克隆抗性细胞株形成，转染pcDNA3．1．hNEP及pcDNA3．1-inNEP（E585V）的细胞NEP表达均增高。结论：获得稳定转染pcDNA3．1-hNEP及ocDNA3．1-inNEP（E585V）的细胞株。     

1990-2004年上海地区临床分离大肠埃希菌耐药性变迁

目的 了解临床分离大肠埃希菌对抗菌药耐药性变迁情况。方法 对1990至2004年上海地区11所医院的细菌耐药监测资料中大肠埃希菌临床分离株的耐药性变迁情况进行分析，细菌药敏采用Kirby-Bauer法。结果 临床分离大肠埃希菌33495株对21种抗菌药药敏试验结果显示，该菌对大多常用抗菌药的耐药性在15年间呈上升趋势。对氨苄西林、哌拉西林的耐药率自69．0％和30．0％分别增至85．0％和71．4％。对头孢菌素类中的头孢唑啉（24．0％-48．3％）、头孢呋辛（18．0％-45．7％）、头孢克洛（33．3％-46．8％）的耐药率均增长，尤其是头孢噻肟的耐药率自1990年的6.0％增至2004年的35．2％。对氟喹诺酮类的耐药性15年间明显增高，且各品种间呈交叉耐药，自1990年的11．0％增至2004年的55．4％。对庆大霉素的耐药率缓慢上升（44．0％-54．0％）。大肠埃希菌对四环素、氯霉素、磺胺甲晤唑／甲氧苄啶（SMZ／TMP）耐药率始终较高。头孢他啶、头孢吡肟、亚胺培南、阿米卡星、β内酰胺类／β内酰胺酶抑制剂复方、呋喃妥因则保持了对大肠埃希菌的良好抗菌活性。产超广谱B内酰胺酶（ESBL）大肠埃希菌所占比例在2000-2004年间逐渐上升，自14．7％增至36．5％，产ESBL菌株耐药性均明显高于非产ESBL者。结论 临床分离的大肠埃希菌对常用抗菌药的耐药性在1990-2004年的15年间普遍呈明显增高趋势。 床分离的大肠埃希菌对常用抗菌药的耐药性在1990--2004年的15年间普遍呈明显增高趋势。     

叶绿酸抑制细胞恶性转化的蛋白表达差异分析

目的：采用蛋白质组学技术分析叶绿酸抑制细胞恶性转化的蛋白差异表达,探讨叶绿酸抗细胞转化的分子机制.方法：一步法分别提取二羟环氧苯并芘（BPDE）诱导的转化细胞B-1和叶绿酸与BPDE共处理的抗转化细胞CB-1总蛋白,应用二维凝胶电泳技术和相应软件ImageMaster 2D3．10分析两种细胞的蛋白质组变化．基质辅助激光解吸电离-飞行时间-质谱（MALDI-TOF-MS）结合数据库检索鉴定部分表达有差异的蛋白斑点。结果：与B-1细胞相比．CB-1细胞中有47个蛋白斑点出现表达差异，其中19个蛋白斑点表达升高．28个蛋白斑点表达降低；质谱分析初步鉴定出5个差异蛋白斑点。结论：叶绿酸抑制细胞恶性转化可引起大量蛋白表达差异．这些差异蛋白可能参与了叶绿酸抗细胞转化的过程。     

胃肠道间质瘤相关PDGFRA基因突变体功能的研究

目的 探讨胃肠道间质瘤中一个新的PDGFRA基因突变位点L839P在肿瘤发生发展中的恶性转化作用.方法 采用脂质体法,将重组质粒稳定转染中国仓鼠卵巢上皮细胞(CHO).应用Western blot法,检测PDGFRA蛋白的表达情况.应用细胞计数法,描绘细胞生长曲线;应用流式细胞仪榆测细胞周期及细胞凋亡,并观察稳转突变型重组质粒CHO细胞在裸鼠体内的成瘤性.将PDGFRA突变型与kit野生型重组质粒共同瞬时转染CHO细胞,用Western blot法检测kit蛋白的表达及其磷酸化状态.结果 阴性对照组、实验组及阳性对照组细胞中均有PDGFRA蛋白表达.实验组和阳性对照组较阴性对照组和空白对照组细胞生长速度加快;空白对照组、阴性对照组、实验组和阳性对照组处于增殖期的细胞比例分别为28.4%、24.5%、43.8%和40.9%,凋亡率分别为1.8%、1.9%、1.5%和1.6%.接种阳性对照组及实验组稳转细胞的裸鼠,3周后均见肿瘤生长.PDGFRA突变型质粒与kit野生型质粒共转染CHO细胞后,磷酸化kit蛋白表达明显增强.结论 PDGFRA基因L839P点突变为功能获得性突变,对正常细胞有较强的恶性转化作用,并口丁激活kit蛋白,导致肿瘤发生.     

生理学教学核心理念变革的探讨

医学教育改革更多的是热衷于授课形式和方法的改革,而忽视了真正能够渗透到教学各方面的教学理念的改革。结合对生理学教学目标的反思和“岗位胜任力”培养的需求,将生理学教学的核心理念总结为四个方面：“三观”要正,帮助学生树立平衡观、辩证观和整体观;“三基”要牢,培养学生掌握基本的知识架构体系、基本的知识获取能力、基本的操作技能;重视学以致用和强化人文素养。上述核心理念在教学实践中得到学生的广泛认可,临床医学专业学生对核心理念的评价明显高于护理专业。下一步教学改革的方向是在教学理念的指导下如何细化授课内容,以适应专业设置越来越细化的现状。     

PMI基因作为选择标记的植物表达载体构建及转化白花丹参体系的建立

目的：构建含有大肠杆菌6- 磷酸甘露糖异构酶（6-phosphomannose isomerase,PMI）基因并替换潮霉素抗性（hygromycin,hyg）基因的植物表达载体pCAMBIA1305-PMI,同时建立以PMI/甘露糖为筛选标记的白花丹参转基因体系。方法：首先从大肠杆菌Escherichia coli DH5α中克隆PMI基因,然后以PMI基因替换植物表达载体 pCAMBIA1305 中的hyg基因,构建了以PMI 基因为选择标记基因的植物表达载体pCAMBIA1305-PMI,并用电击转化方法导入根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens LBA4404 中,用叶片浸染法转化白花丹参。结果：在白花丹参MS+6-BA 1.5 mg·L^-1+NAA 0.1 mg·L^-1固体分化培养基中附加20 g·L^-1甘露糖和10 g·L^-1蔗糖为碳源的选择压力下,pCAMBIA1305-PMI 的转化率为23.7%,对再生植株用PCR检测证实了PMI基因的导入。结论：建立了以PMI-甘露糖为选择系统的白花丹参转基因体系,可应用于后续目的基因的转化奠定了基础。