烧伤创面水疱液对人骨髓间充质干细胞体外培养及表型转化的影响

目的 了解烧伤水疱液对人骨髓间充质于细胞(MSC)体外培养及表型转化的影响.方法 体外分离、培养、扩增、鉴定人骨髓MSC,收集烧伤患者伤后12、24、48 h水疱液,分别加入MSC培养液中.分为水疱液1组:MSC培养液中加入伤后12 h水疱液;水疱液2组:MSC培养液中加入伤后24 h水疱液;水疱液3组:MSC培养液中加入伤后48 h水疱液;对照组:常规培养.各组所加水疱液体积分数均为20%.观察水疱液微生物生长情况及各组MSC生长情况.流式细胞仪检测培养8 d时各组MSC中CD44、细胞角蛋白7(CK7)阳性表达率.结果 15个水疱液标本细菌、真菌培养均为阴性;各组MSC细胞形态无明显变化,但各水疱液组细胞数量均少于对照组,水疱液3组细胞数量下降最明显.水疱液1、2、3组CD44阳性表达率分别为(83.0±3.1)%、(77.2±2.9)%、(65.1±2.3)%,均低于对照组[(89.5±3.2)%,P<0.01];水疱液1、2、3组CK7阳性表达率分别为(24.06±0.11)%、(16.41±0.09)%、(4.48±0.07)%,明显高于对照组[(3.87±0.04)%,P<0.01].结论 烧伤创面水疱液对MSC体外培养有明显的抑制作用,并具有一定的促进MSC表型转化作用.     

骨髓间充质干细胞静脉移植对扩张型心肌病大鼠毛细血管生成的影响

目的观察骨髓间充质干细胞（MSCs）经静脉途径移植对阿霉素诱导的扩张型心肌病（DCM）大鼠心功能的影响。方法建立大鼠阿霉素性心肌病模型,随机分为三组：DCM空白组（B组）、静脉移植组（C组）和静脉对照组（D组）,另设正常对照组（A组）。经尾静脉注射在体外扩增并DAPI标记的骨髓间充质干细胞和培养基至C组和D组大鼠,A组和B组大鼠不干预。移植后8周心脏彩超观察左室舒张末径（LVDD）、左室射血分数（LVEF）,多导生理记录仪观察左室最大压力上升速率（＋LVdp/dtmax）、左室最大压力下降速率（-LVdp/dtmax）,并分析组织病理学特征。结果细胞移植后8周,C组LVEF高于B组和D组;LVDD稍低于B组和D组;＋LVdp/dtmax明显高于B组,也显著高于D组;-LVdp/dtmax明显高于B组和D组;C组心肌中可见带有蓝色荧光的DAPI标记的骨髓MSCs,心肌胶原容积百分比低于B组和D组,毛细血管计数高于B组和D组;C组VEGF水平明显高于B组和D组。结论骨髓MSCs静脉移植治疗阿霉素诱导的扩张型心肌病大鼠,提高VEGF水平,促进心肌毛细血管新生,减少胶原纤维,改善心功能。     

Nidogen Plays a Role in the Regenerative Axon Growth of Adult Sensory Neurons Through Schwann Cells

We previously reported that nidogen is an extracellular matrix protein regulating Schwann cell proliferation and migration. Since Schwann cells play a critical role in peripheral nerve regeneration, nidogen may play a role in it via regulation of Schwann cells. Here, we demonstrate direct evidence that nidogen induces elongation of regenerative axon growth of adult sensory neurons, and that the effect is Schwann cell dependent. Continuous infusion of recombinant ectodomain of tumor endothelial marker 7, which specifically blocks nidogen function in Schwann cells, suppressed regenerative neurite growth in a sciatic nerve axotomy model. Taken together, it is likely that nidogen is required for proper regeneration of peripheral nerves after injury.     

Unrelated Hematopoietic Stem Cell Transplantation for Children with Acute Leukemia: Experience at a Single Institution

We evaluate the outcomes in children with acute leukemia who received allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HCT) using unrelated donor. Fifty-six children in complete remission (CR) received HCT from unrelated donors between 2000 and 2007. Thirty-five had acute myeloid leukemia, and 21 had acute lymphoid leukemia. Stem cell sources included bone marrow in 38, peripheral blood in 4, and cord blood (CB) in 14. Four patients died before engraftment and 52 engrafted. Twenty patients developed grade II-IV acute graft-versus-host disease (GVHD) and 8 developed extensive chronic GVHD. With median follow-up of 39.1 months, event free survival and overall survival were 60.4% and 67.5%, respectively, at 5 yr. Events included relapse in 10 and treatment-related mortality (TRM) in 10. The causes of TRM included sepsis in 4, GVHD in 4 (1 acute GVHD and 3 chronic GVHD), veno-occlusive disease in 1 and fulminant hepatitis in 1. Patients transplanted with CB had event free survival of 57.1%, comparable to 63.2% for those transplanted with other than CB. In conclusion, HCT with unrelated donors is effective treatment modality for children with acute leukemia. In children with acute leukemia candidate for HCT but lack suitable sibling donor, unrelated HCT may be a possible treatment option at the adequate time of their disease.     

坐标定位划痕法在研究“细胞创面”愈合率中的应用

目的：改良传统“细胞创面”模型的制备方法,提高对“细胞创面”愈合率的统计的精确性。方法：在6孔板每一孔外底面用刀尖划上横纵坐标轴,用绿色记号笔在横轴的上、下方平行于横轴各画5条等距离的绿带。接种目的细胞,待其长满内表面时用1000μl微量移液器的吸头在纵轴的左、右平行于纵轴各划2条等距离的细胞缺损带。在观察时间点观察绿带与细胞缺损带重叠形成的“矩形区域”的宽度或面积,计算愈合率。结果：可以特定追踪观察每个“矩形区域”内“细胞创面”愈合率情况,且“矩形区域”的例数可以符合统计学要求。结论：坐标划痕法是一种较精确统计“细胞创面”愈合率可行的方法。     

人脐血源和骨髓源间充质干细胞神经前体细胞分化的研究

目的 对比研究人脐血和骨髓来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)体外的分离、培养和生物学特性,并观察其分化潜能和形态学变化,为组织工程选取种子细胞提供实验依据.方法 Ficoll密度梯度离心结合贴壁培养法分别分离纯化成人骨髓和脐血源MSCs,体外培养和连续传代,并在含有2%B27的Neurobasal培养基中添加碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子,将获得的MSCs向神经干细胞定向诱导,利用倒置显微镜连续观察细胞培养、传代和向神经细胞表型转化过程的形态学变化;采用免疫组化和荧光免疫组化法对诱导后细胞进行鉴定.结果 原代分离的骨髓间充质干细胞(BMSCs)在接种后48 h贴壁,7 d细胞呈长梭形,有一定的方向性,并达到90%融合;而脐血间充质干细胞(UMSCs)48 h后贴壁,似乎贴的不牢,持续14d才能形成小丛、小簇、小集落,21 d排列才有一定的方向性.培养基添加神经营养因子诱导后的细胞呈现典型的神经前体细胞样表型,免疫组化和免疫荧光结果显示,诱导后的细胞能特异性表达神经元特异性标志β微管蛋白(β-tubulin)和星形胶质细胞特异性标志神经胶质相关蛋白(GFAP).结论 人脐血和骨髓中含MSCs,且具备其基本恃征,体外培养UMSCs生长速度比BMSCs缓慢10 d～15 d左右,传代以后的各组细胞生长速度与形态无明显差异.骨髓和脐血来源的MSCs在体外可定向诱导分化为神经细胞.     

供体骨髓间充质干细胞抑制肝移植大鼠免疫排斥的研究

目的 探讨供体骨髓间充质干细胞(MSCs)抑制肝移植大鼠免疫排斥的作用.方法 实验按照随机数字表法分为3组,每组14对雌性大鼠,建立Wistar-SD大鼠原位肝移植模型.A组:肝移植术中输注生理盐水;B组:肝移植术后隔天一次给予他克莫司(0.25 mg/kg)灌胃2周;C组:肝移植术中输注与A组同剂量的雄性Wistar大鼠的MSCs.观察术后第10天肝功能的变化、病理改变、TGF-β1与IL-10的表达、Y染色体定位及受体存活时间.采用完全随机化设计多组比较方差分析AST、ALT值,LSD法分析组间差异;病理分级采用ridit法分析;Kaplan-Meier法计算存活率,Log-rank检验进行生存分析.结果 肝移植术后第10天A、B、C组ALT分别为(756±104)、(197±49)、(103±31)U/L,AST分别为(635±134)、(331±78)、(150±38)U/L,3组ALT和AST比较差异均有统计学意义(F=158,265,P<0.05);两两比较发现,B组及C组均优于A组,且C组优于B组.A组ridit均值为0.8333,为重度排斥,B、C两组ridit均值分别为0.4583、0.2083,排斥反应较A组显著减轻,且C组较B组级别更低.A、B、C组TGF-β1阳性表达率分别为18%±5%、69%±20%及85%±24%,3组比较差异有统计学意义(F=191,P<0.01).A、B、C组IL-10阳性表达率分别为21%±5%、75%±14%及91%±21%,3组比较差异有统计学意义(F=672,P<0.01);B、C两组TGF-β1和IL-10呈强阳性表达且C组比B组更明显,而A组则为弱阳性表达.原位杂交检测发现,C组含有带Y染色体的雄性MSCs,主要在汇管区聚集.A、B、C组大鼠50 d存活率分别为0、10%、90%,3组大鼠存活率比较差异有统计学意义(χ~2=36,P<0.01),C组中位存活时间为63 d,较A组11 d延长,且C组长于B组.结论 肝移植同时向供体输注MSCs能够抑制受体对移植肝的免疫排斥.     

hIL-10基因修饰的骨髓间充质干细胞的体外免疫抑制作用

目的研究hlL．10基因修饰的骨髓间充质干细胞（mesenchymalstarecell,MSC）对异种混合T淋巴细胞增殖的影响。方法反转录PCR克隆hlL-10基因并构建慢病毒hlL-10／pLOX—CWgfp,然后将hIL．IO／pLOX—CWgfp转入豚鼠MSC内;ELISA法测定hIL-10基因修饰的MSC（hlL-10-MSC）培养上清液内hIL-10含量;CCK-8法检测hIL-10-MSC和其培养上清液对体外混合淋巴细胞培养的影响。结果hIL-10．MSC培养上清液的hIL-10水平明显高于未转染hIL-10者（P〈0．05）;hIL-10-MSC能抑制异种T淋巴细胞混合培养的增殖反应（P〈0．05）;加入IL-2能逆转MSC的抑制作用（P〈0．05）;hIL-10-MSC培养上清液能抑制异种T淋巴细胞混合培养的增殖反应（P〈0．05）。结论hIL-10-MSC和其培养上清液对混合异种淋巴细胞培养有显著的抑制作用。     

人骨髓来源内皮祖细胞的分离培养及生物学特性的鉴定

目的建立人骨髓来源的内皮祖细胞（EPCs）分离、培养、诱导分化与鉴定的方法,并探讨其生物学特性。方法收集腰椎间盘退变性疾病患者的髂骨骨髓24例,密度梯度离心法分离的单个核细胞接种于纤维连接蛋白包被的培养瓶,贴壁培养,EGM-2培养基诱导扩增EPCs。Dil-ac-LDL、FITC．UEA—I荧光双标、流式细胞术鉴定EPCs,计算纯度。透射电镜和管腔形成实验鉴定EPCs向血管内皮细胞（ECs）分化的能力。结果培养72h换液时可见贴壁细胞形成明显细胞克隆集落,第5天集落数增加,1周后细胞融合达80％,至第14天细胞呈铺路石样排列。培养至第7天细胞Dil-ac-LDL、FITC-UEA-I双荧光染色阳性率为（95．1±4．0）％,CD133、CD34、KDR、VE。Cadherin标记阳性率分别为（18．5±4．4）％、（45．4±7．8）％、（66．7±7．2）％、（20．5±5-3）％。培养第10天细胞透射电镜显示成熟血管ECs特有的Weibel-Palade小体。管腔形成实验表明,体外ECMatrix上培养7至12d的EPCs具有较强的管腔形成能力。结论采用密度梯度离心与贴壁培养法分离、培养的人髂骨骨髓来源的单个核细胞在特定诱导条件下可分化为EPCs,纯度较高,稳定性和重复性好。EPCs培养7至12d,具有良好的管腔形成能力。     

解毒消癥饮对肝癌细胞株HepG2线粒体膜电位的影响

目的 探讨中药复方解毒消癥饮诱导肿瘤细胞凋亡的机制. 方法 采用体外培养人肝癌细胞株HepG2,用解毒消癥饮含药血清干预24 h,MTT法检测细胞增殖情况;流式细胞术检测线粒体膜电位的改变. 结果 解毒消癥饮含药血清组与对照组和空白血清组比较,细胞增殖明显抑制,线粒体膜电位明显下降,差异有统计学意义(P<0.05). 结论 解毒消癥饮诱导人肝癌细胞株HepG2凋亡的机制可能是通过崩溃线粒体跨膜电位,从而引发细胞早期凋亡.