多发性尿路上皮肿瘤的单克隆起源

目的　验证泌尿系上皮移行细胞癌单克隆起源学说。　方法　应用免疫组化染色方法 ,检测 10例 2 2块多发性尿路上皮移行细胞癌组织标本p5 3蛋白的表达 ,以此判断多发肿瘤灶基因的突变 ,比较多发肿瘤灶的基因型。　结果　同一患者不同部位肿瘤标本 p5 3染色阳性细胞的比例和染色强度完全一致 ,因此 ,肿瘤多克隆起源的可能性为 0 .5 1× 0 .5 1× 0 .5 2 × 0 .5 1× 0 .5 2 × 0 .5 1×0 .5 1× 0 .5 1× 0 .5 1× 0 .5 1=0 .5 12 =0 .0 0 0 12 2 (<10 -3 ) ,即同一患者多个肿瘤灶的基因型相同。　结论　多发性尿路上皮肿瘤为单克隆起源     

高低不同转移特性骨肉瘤亚克隆细胞系的分离与鉴定

目的　建立高低不同转移特性人成骨肉瘤MG 63亚克隆细胞系 ,为研究成骨肉瘤转移机制提供较好的实验模型。方法　通过体外培养和裸鼠体内移植 ,初步分离并建立了 2个亚克隆细胞系A1和A2 ,并利用细胞电泳、细胞增殖、琼脂克隆形成、体外侵袭实验、裸鼠体内异位和原位移植对两者的生物学特性进行比较、分析和鉴定。结果　A1和A2的电泳率、琼脂克隆形成能力、体外侵袭能力、自发性肺转移率分别为 (1.0 8± 0 .12 ) μm ,(0 .64± 0 .13 ) μm ;2 1.0± 2 .3 ,9.5±2 .9;186.0± 16.7,84.0± 12 .6;10 0 .0 0 % ,6.67% ,A1均明显高于A2 ,两者的差异有统计学意义(P <0 .0 1)。结论　高低不同转移特性的人成骨肉瘤MG 63亚克隆细胞系的建立 ,能为成骨肉瘤转移机制的研究提供较理想的实验模型。     

问号钩端螺旋体属lipL32/1-ompL1/1融合基因的真核表达及其表达产物的免疫反应性

目的:构建问号钩端螺旋体(简称钩体)的融合基因lipL32/1-ompL1/1真核表达系统并鉴定表达产物的免疫反应性.方法:采用连接引物PCR构建融合基因lipL32/1-ompL1/1,克隆测序后构建lipL32/1-ompL1/1的毕赤酵母真核表达系统pPIC9K-lipL32/1-ompL1/1-P.pastorisGS115.用MM和MD平板分离His Mut 型菌落,YPD平板筛选出G418高抗性的His Mut 转化子.以酵母裂解酶处理的高拷贝转化子His Mut 克隆裂解产物为模板,5'AOX1和3'AOX1为引物,用PCR检测所构建的毕赤酵母工程菌株染色体DNA中的目的融合基因.在BMMY培养基中用甲醇诱导目的重组蛋白rLipL32/1-rOmpL1/1表达.采用硫酸铵沉淀,Ni-NTA亲和层析提纯培养物上清液中的rLipL32/1-rOmpL1/1.采用SDS-PAGE和Western blot分别检测rLipL32/1-rOmpL1/1的产量及其免疫反应性.结果:获得的lipL32/1-ompL1/1融合基因约为1 794 bp.其核苷酸和氨基酸序列与原始lipL32/1和ompL1/1基因型比较,相似性分别高达99.94%和100%.所构建的真核表达系统可分泌rLipL32/1-rOmpL1/1,SDS-PAGE后位于预期位置处,产量约占上清总蛋白的40%.rLipL32/1和rOmpL1/1兔抗血清均能与表达的rLipL32/1-rOmpL1/1结合.结论:本研究成功地构建了钩体lipL32/1-ompL1/1融合基因高效毕赤酵母真核表达系统,所表达的融合蛋白具有特异的免疫反应性,可作为研制钩体新疫苗的候选抗原.     

牙龈卟啉单胞菌菌毛相关外膜蛋白pgmA基因的克隆和表达

目的:克隆牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)pgmA基因,构建pgmA基因表达载体,鉴定其表达产物的免疫性.方法:采用高保真PCR分别从牙龈卟啉菌ATCC 33277和47A-1菌株中扩增pgmA基因,T-A克隆后测定核苷酸序列,构建pET32a的pgmA表达载体,在E.coli BL21DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达,采用兔抗融合蛋白血清的Western blot鉴定其免疫反应性和免疫原性,采用ELISA 检测65株临床分离牙龈卟啉单胞菌与PgmA融合蛋白抗血清的反应情况.结果:所克隆的牙龈卟啉单胞菌ATCC 33277与47A-1菌株pgmA基因的核苷酸序列同源性为100%,与报道的相应核苷酸序列同源性为98.98%,氨基酸序列同源性高达99.18%.pET32a-pgmA-BL21DE3系统的PgmA融合蛋白表达量为细菌总蛋白的50%左右.PgmA融合蛋白免疫家兔能获得相应抗体并与PgmA蛋白发生结合反应.ELISA结果证实92.3%的牙龈卟啉菌临床菌株(60/65)能与PgmA融合蛋白抗血清发生结合反应.结论:本研究成功地构建了Pg pgmA高效表达系统,所表达的PgmA融合蛋白有良好的免疫原性和免疫反应性,可作为Pg检测试剂盒和Pg疫苗的候选抗原.     

耳蜗α1D L-型电压门控钙通道剪切异构体的克隆和体外表达研究

目的 克隆大鼠耳蜗毛细胞电压门控钙通道α1D剪切异构体并在体外表达.方法 以耳蜗基底膜中组织总RNA为模板,利用长距离RT-PCR克隆耳蜗毛细胞表达的电压门控钙通道α1D剪切异构体,并利用异源表达系统在哺乳动物细胞系进行表达.结果 克隆的耳蜗毛细胞表达的α1D剪切异构体全长cDNA长达6.2kb,构建了哺乳动物表达载体,建立了稳定表达该剪切异构体的细胞系.结论 内耳毛细胞表达组织特异性的α1D剪切异构体,该异构体在外源表达系统中的表达为今后研究耳蜗α1D L-型钙通道蛋白的电生理和药理特性奠定了基础.     

HPV16L1E7的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的：研究人乳头瘤病毒(HPV)的主要衣壳蛋白L1和主要的转化蛋白E7的融合基因在原核细胞中的表达，为研制HPVl6L1E7疫苗和诊断试剂盒提供依据。方法：采用聚合酶链反应(PCR)以重组质粒pUCl9UE7为模板扩增HPVl6L1E7基因片段，克隆至载体pMDl8-T中，并用限制性内切酶将HPVl6L1E7基因切下，克隆至原核表达质粒pQE30中，经IPTG诱导表达，再使用SDS-PAGE和蛋白印迹检测其抗原性和表达水平。结果：HPVl6L1E7融合蛋白能被抗HPVl6L1抗体识别，分子量为66KD，经IPTG诱导4h后，表达的HPVl6L1E7融合蛋白占菌体总蛋白量的25％以上。结论：成功构建的表达载体pOE30-L1E7可在原核表达细胞中高效表达，且表达出的HPVl6L1E7融合蛋白具有反应活性，可与HPVl6抗体发生反应。     

长链非编码RNA H19促进人胃癌MGC-803细胞增殖的实验研究

目的 探讨长链非编码RNA H19在胃癌组织及细胞株中的表达情况及其对人胃癌细胞增殖的影响。方法 采用实时定量PCR检测30例胃癌组织及其对应癌旁组织,以及胃癌细胞株MGC-803、SGC-7901和胃黏膜上皮正常GES-1细胞中H19的表达情况;分析胃癌组织H19表达与临床病理特征（年龄、性别、分化程度、肿瘤浸润深度、淋巴结转移及TNM分期）的关系。将胃癌MGC-803细胞分别转染H19特异性小干扰RNA（si-H19组）和阴性对照序列（si-NC组）,分别采用四甲基偶氮唑蓝法和克隆形成实验检测两组细胞的增殖情况。结果 与癌旁组织和黏膜上皮正常细胞相比较,胃癌组织和细胞株中H19的表达水平升高。胃癌组织中H19表达与年龄、性别、分化程度均无关（P＞0.05）,但与肿瘤浸润深度、淋巴结转移及TNM分期有关（P＜0.05）。si-H19组中H19表达水平低于si-NC组,且细胞活力和细胞克隆数均低于si-NC组,以上差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论 胃癌组织及细胞株中H19呈高表达,下调H19表达能显著抑制胃癌细胞的增殖能力,H19可能参与了胃癌的发生、发展。     

人喉癌Hep-2细胞株CD133+肿瘤干细胞生物学特性研究

目的 研究喉癌Hep-2细胞株中CD133+肿瘤细胞的干细胞特性及其生物学特性.方法 流式细胞仪分选Hep-2细胞株中CD133+肿瘤细胞,Transwell法检测CD133+肿瘤细胞侵袭能力及三代克隆形成能力;CD133+肿瘤细胞与紫杉醇共培养,10 Gy的直线加速器照射CD133+肿瘤细胞,四甲基偶氮唑蓝法计算其相对存活率和生长抑制率,观察其放化疗抵抗性.结果 CD133+细胞比例为3.1％±0.2％,流式细胞仪分选纯度可达90.2％±5.5％,分选后的CD133+细胞贴壁,呈团块状、克隆球状生长.增殖速度明显较CD133-细胞快;Transwell实验中,相同视野CD133+细胞穿膜细胞数(526±39)个/每视野,而CD133-细胞为(220±20)个/每视野,二者差异有统计学意义(t=22.08,P＜0.01);CD133+细胞三代克隆形成率分别为30.0％±4.7％、32.2％±3.6％、32.7％±3.4％,CD133-细胞三代克隆形成率分别为15.2％±2.2％、12.0％±2.5％、13.8％±3.3％,同代比较差异有统计学意义(t值分别为8.99、14.66、12.69,P值均＜0.01).在紫杉醇共培养体系中,CD133+细胞24 h、48 h、72 h的相对存活率分别为90.1％±5.9％、85.1％±7.1％、70.3％±6.4％,均高于同时期对照组CD133-细胞(t值分别为5.24、8.18、8.14,P值均＜0.01);放射线照射后,CD133+细胞生长抑制率30.0％±7.1％,显著低于CD133-细胞的55.0％±6.3％(t=8.30,P＜0.01).结论 CD133+ Hep-2细胞所占比例较小,具有强的增殖、侵袭能力及克隆形成能力,对放化疗有抵抗性,具有干细胞特性.靶向CD133+肿瘤细胞,有望有效杀伤喉癌干细胞.     

秀丽隐杆线虫C31B8.8基因的克隆、表达及免疫特性分析

目的克隆、表达野生型秀丽隐杆线虫C31B8.8基因,并分析其免疫特性。方法提取人工培养的秀丽隐杆线虫总RNA,逆转录合成cDNA,PCR扩增C31B8.8基因,克隆入pMD-18T载体,测序正确后将C31B8.8基因亚克隆入带有组氨酸标签的表达载体pET-30a,转入大肠埃希菌BL21中,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导,表达目的蛋白C31B8.8。用钴离子柱亲和层析法纯化该蛋白。融合蛋白采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定和蛋白质印迹(Western blotting)分析。10只BALB/c小鼠随机均分为抗原免疫组和佐剂对照组,抗原免疫组以纯化的重组C31B8.8蛋白免疫小鼠,抗原免疫剂量为40μg/(只·次),共免疫4次,每周免疫1次。佐剂对照组以PBS代替抗原,同法免疫小鼠。每次免疫前取血,末次免疫后1周眼球采血,分离血清,ELISA检测不同时期血清抗体效价。同时以C31B8.8蛋白和广州管圆线虫Ⅳ期幼虫虫体可溶性蛋白作为抗原进行Western blotting。结果 DNA测序结果显示重组质粒构建成功,并诱导出重组C31B8.8蛋白。重组蛋白经质谱鉴定和Wester...     

Comparison of bacterioplankton communities in three heavily polluted streams in China

Objective To compare the bacterioplankton communities in streams exposed to pollution of different types. Methods The bacterioplankton communities in three selected heavily polluted streams were investigated by using terminal‐restriction fragment length polymorphism (T‐RFLP) analysis in combination with 16S rRNA gene clone library analysis. Results Both T‐RFLP and 16S rRNA gene clone library revealed a great difference in bacterioplankton community composition in the different streams. Conclusion This work ...