人肺癌高低转移细胞株差异表达基因的筛选

目的 筛选高低转移能力人肺癌细胞株PG-BE1和PG-LH7间差异表达基因.方法 进行两次抑制性消减杂交,第一次以PG-BE1细胞株为实验方、PG-LH7株为驱动方构建正向消减文库;第二次以PG-LH7株为实验方、PG-BE1为驱动方构建反向消减文库.筛选出来的阳性克隆进行测序,并在Gene Bank数据库中进行同源性比较.结果 2个消减文库共得到122个阳性克隆,随机选取10个克隆测序并进行同源性分析,发现其中9条序列来自于已知基因,另外1条序列为新的基因序列标签.结论 成功构建了高低转移力人肺癌细胞株的双向消减杂交文库.     

膀胱癌多发或复发的克隆起源

目的 探讨人膀胱移行上皮癌多发性、复发性的细胞克隆起源。方法 采用ｐ５３基因突变的ＰＣＲ－ＳＳＣＰ分析及ＤＮＡ测序检测６例患者１４个表浅、低分级原发加多发或复发的膀胱移行上皮癌标本及ｐ２１＾ＷＡＦ１／ＣＩＰ１蛋白的表达。结果 在１４个膀胱移行上皮癌标本均有ｐ５３基因的点突变,同一例患者所有标本的点突变分别在同一位点上;１４个膀胱移行上皮癌标本中仅有５个有ｐ２１＾ＷＡＦ１／ＣＩＰ１蛋白的表达。结论     

人胃动素受体基因表达载体的构建

目的 构建人胃动素受体基因的原核表达载体。方法 通过巢式PCR扩增人基因组DNA，获得人胃动素受体基因的658bp的靶片段，将其粘端克隆，然后应用限制性酶切、半巢式PCR扩增及测序鉴定。结果 成功克隆了人胃动素受体基因表达片段，测序证实读框正确。结论 人胃动素受体表达片段获得成功克隆。     

热化放三联因子对Hela细胞杀伤效应的实验研究

本文以体外培养的宫颈癌Hela细胞系为模型,以细胞克隆形成实验及细胞周期相分布测定为指标,观察了高温、顺铂及放射线对细胞的杀伤效应。结果表明:①从细胞克隆形成实验所得存活分数(SF)证明热化或热放二联因子较热、化、放任何单一因子对细胞的杀伤效应大,且热化优于热放。热化放三联因子应用时,杀伤作用更大。②从流式细胞仪测定的细胞周期时相分布表明,Hela细胞周期时相对热化因子较敏感,剂量小时,S+G_2/M增殖期细胞增加,呈激惹反应;剂量大时,S+G_2/M增殖期细胞减少,呈抑制反应。热放组于24小时无明显改变,96小时S+G_2/M增殖期细胞呈轻度增加现象。     

含脂氧素A4受体同源基因真核表达载体的构建与转染系膜细胞

目的构建小鼠脂氧素A4受体同源基因(LRHG)的真核表达载体,克隆后转染小鼠肾小球系膜细胞,观察LRHG编码的脂氧素A4受体样蛋白(LRLP)在系膜细胞中的表达.方法应用PCR方法,以小鼠睾丸cDNA为模板,扩增出LRHG基因片段,插入质粒pGEM-T中,转化入大肠杆菌JM109.扩增阳性重组质粒,经酶切后纯化并测序鉴定目的片段.构建含6×组氨酸(His)基因的真核表达载体pcDNA3.1/LRHG-his,转化入大肠杆菌JM109扩增,酶切后再测序鉴定目的片段,抽提质粒后转染系膜细胞,进行Western blot鉴定LRLP的表达.结果测序鉴定表明,克隆的LRHG序列与GenBank中LRHG原序列100%符合,应用抗6×His抗体进行Western blot鉴定系膜细胞中有LR-LP的表达.结论成功地构建了真核表达载体pcDNA3.1/LRHG-his,并转染了肾小球系膜细胞,获得了稳定的表达.     

丙型肝炎病毒核心区蛋白在HepG2细胞中的表达

目的 :构建能稳定表达丙型肝炎病毒核心区蛋白的哺乳动物细胞系 ,以便对丙型肝炎病毒核心区蛋白的抗原性及其他功能作进一步研究。方法 :通过PCR扩增丙型肝炎病毒核心基因 ,将其亚克隆入真核表达质粒pcDNA3.1( )中 ,用脂质体包裹后转染肝癌细胞系HepG2 ,通过G4 18筛选获得稳定转染细胞系 ,并通过间接免疫荧光法检测HepG2中丙型肝炎病毒核心区蛋白的表达。结果 :克隆的基因全长 5 94bp ,并经测序和重组质粒双酶切证实为所需目的基因 ;经间接免疫荧光验证实转染了目的基因的HepG2细胞中有丙型肝炎核心区蛋白的表达。结论 :丙型肝炎病毒核心区蛋白能在HepG2细胞中稳定表达。     

SARS冠状病毒S蛋白受体结合域的克隆测序

目的 从来源于人和果子狸的SARS冠状病毒S蛋白基因中,获得受体结合域(RBD)基因的克隆.方法 用PCR方法扩增RBD基因,将其克隆到pGEM-T Easy载体,转化后挑取阳性克隆进行酶切和测序鉴定,并分析RBD基因序列.结果 获得了人和果子狸来源的RBD的基因片段,长度为579 bp,两者具有高度的同源性.结果 RBD是SARS冠状病毒与靶细胞结合的部位,本工作成功克隆了SARS冠状病毒的RBD基因,为该基因的表达和功能研究奠定了基础.     

单纯疱疹病毒DNA部分BamHI酶切片段在大肠杆菌内克隆的研究

单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)标准株SM_(44)DNA部分BamH Ⅰ酶切片段用T_4DNA连接酶在体外与pBR_(322)重组,转入大肠杆菌内,共获得重组菌58株。用质粒快速抽提方法,检测重组菌有无质粒及质粒的大小,从中选出H_(919)菌株做鉴定。经纯化质粒、酶切和核酸杂交试验,证明该菌株的质粒插有分子量近似1.51×10~6 daltons,约含2322bp的SM_(44)DNA片段。     

携带大鼠白细胞介素-10基因重组腺病毒载体的构建及其在肝星状细胞中的表达

目的　构建载有白细胞介素 10 (IL 10 )基因的 ,能在肝星状细胞 (HSC)稳定表达的重组腺病毒载体 ,为将来的肝纤维化基因治疗提供基础。方法　将IL 10cDNA克隆于腺病毒穿梭质粒PAdTrack CMV ,得到重组质粒PadTrack CMV IL 10。采用电穿孔法将质粒PadTrack CMV IL 10与腺病毒骨架质粒PadEasy 1共转化E .coliBJ5 183细胞 ,通过在细胞内同源重组 ,生成带有IL 10基因的重组腺病毒载体。重组腺病毒质粒经过 2 93细胞的扩增及CsCl的纯化 ,感染HSC细胞。结果　经形态学、病毒DNA酶切、聚合酶链反应 (PCR)和逆转录 (RT ) PCR等方法的鉴定 ,证实了载体构建的正确性 ,经测定 ,病毒滴度为 2 .5× 10 10 efu/ml。结论　成功构建带有IL 10cDNA的重组腺病毒载体 ,所携带的IL 10载体能够转染大鼠HSC并在HSC中稳定表达 ,为进一步的研究打下了基础。     

前列腺特异性膜抗原启动子增强子调控重组质粒的构建及鉴定

目的探讨前列腺特异性膜抗原(PSMA)启动子和增强子调控目的基因表达的前列腺细胞特异性，了解增强子增强转录效率的能力。方法采用PCR方法从前列腺癌细胞DNA中分别扩增PSMA启动子和增强子序列，先后克隆到含有报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的质粒载体，脂质体介导基因转染不同癌细胞并观察GFP在不同细胞的表达情况。结果成功构建质粒pEGFP—PS—MAPro和pEGFP-PSMAEP，转染结果显示PSMA表达阳性的LNCaP细胞中存在GFP的有效表达，且pEGFP—PSMAEP的调控转录能力较pEGFP—PSMAPro强20倍。结论PSMA启动子增强子调控GFP表达的重组质粒的构建证明该调控序列具有前列腺细胞特异性，增强子能够明显增强启动子的转录效率，增加了目的基因的表达水平。PSMA启动子和增强子的共调控可以保证基因表达的强度和细胞特异性，为前列腺癌基因靶向性治疗研究提供实验依据。